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三、DNA分子体外重组 基因工程的策略 l确定重组实验的目的——是获得目的基因，还是获得表达产物。 l根据经济情况选择合适的用品——包括质粒（可以买成品，也可以向人索取质粒自己提取）、酶的选择等。 l制定周密的实验计划，基因工程的实验周期都比较长，如计划不周，将造成时间和经济上的损失。 l酶切位点的选择 l选择合适的连接方式 ?????一、常用的克隆载体 ?㈠质粒 plasmid 1．质粒的一般特点 l?细菌质粒是一些双链闭环的DNA分子， l?这些质粒都是独立于染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。 l通常，质粒含编码某些基因的酶，这些酶在一定环境下对宿主细胞有利。由质粒产生的表型对抗生素的抗性、产抗生素、降解复杂有机化合物，以及产生大肠杆菌素，及限制酶、修饰酶等。 l?质粒的复制能力质粒都带有独立的复制子，能独立的自我复制。但在复制时必须依赖宿细菌的酶。 l?? 质粒的不亲和性(不相容性) l质粒的三种状态 松驰型和严紧型 质粒的转移性 多数质粒在自然条件下可以通过细菌结合的作用转移到新的宿细胞中。然而，由于质粒缺少一种转移所必须的mob基因，因此不能独立的从一个细菌到另一个细菌的接合转移。 选择标记 质粒载体的发展经历了三个阶段： 第一阶段：将选择标记引入含有复制子的质粒中。 最早用作克隆载体的质粒子有多种局限性：复制效率低；带有不适合的选择标记；酶切位点少且不集中等，pBR322是早期最为成功的将所有理想的特性囊括于一身的质粒载体。 pBR322 第二阶段：高效型载体的发展 发展的趋势是调整载体的结构，提高载体的效率，减少载体的长度，扩充载体的容纳外源DNA的能力。这期间质粒的代表是：pUC19等。 ⑵pUC18,pUC19 第三阶段：引入多种用途的辅助序列 这些用途包括通过组织化学检测方法肉眼鉴定重组克隆，产生用于序列分析的单链DNA，外源蛋白的大量表达等用途的质粒载体。 pGEM-T ㈡λ噬菌体 1．λ噬菌体分子生物学 λ噬菌体的基因组是一长度50kb的双链DNA，其末端为长12bp的天然互补单链（粘端）。当它进入宿细胞后其粘端会配对结合成环形，它在侵入宿细胞后可以两种方式进行复制： 裂解性生长 溶源性生长 2．λ噬菌体作为载体所具有的特征 不利因素：野生型λ噬菌体有一个庞大的基因组，其DNA可分为头部、中央部分和尾部三个部分。其基因组由头部（由7个基因组成）、尾部（由11个基因组成）、重组基因（5个基因和一个识别位点）、正调控基因（2个基因）、负调控基因（5个基因）、DNA合成基因（2个基因）、裂解基因（2个基因）、转录调控及识别位点组成。在没有改造的情况下， λ噬菌体无法插入较大的外源DNA片段，无较集中的酶切位点和好的识别标置。 3．λ噬菌体载体的改造： 在λ噬菌体DNA的中央部分（约占30%）是其生长的非必须区，当外源基因取代该区或该区缺失时，对噬菌体的生长不会造成影响。此外，外源基因不超过其本身的10倍数时，均可被包装为成熟颗粒，具有噬菌体活性。 目前使用的λ噬菌体载体都经过了改造，在其中加上了较集中的酶切位点、还加上了细菌的启动子，这不仅使其具有扩增外源DNA的能力，还使它能够表达外源基因的产物。 λgt10和λgt11的结构 λ噬菌体的用途： λ噬菌体主要用于cDNA文库的构建。 ㈢粘性质粒 粘性质粒是一种将λ噬菌体和质粒两种载体结合起来形成的一种人工载体。它具有如下特征： ⑴含有质粒的抗药性标记，如Ampr基因。 ⑵载体带有噬菌体的cos区，所以对其进行体包装是必不可少的。 ⑶具有多克隆位点。 ⑷形体本身的体积很小，但容量大，可插入40kb大小的DNA片段。 ⑸一般非重组的载体体积小，而无法进行体外包装，因而无法转染细菌，只有包装了的重组体才能进入细菌，有利于筛选。 ㈣M13噬菌体 M13噬菌体是一种大肠杆菌的噬菌体它在转染大肠杆菌后进行一段时间的复制后开始进行不对称复制，而形成大量的单链DNA，而后将这些单链DNA进行包装病毒颗粒后释放到细菌外，利用这一特点，可大量克隆单链的DNA分子用于制备核酸探针和DNA测序的材料。 ㈤大容量测序用载体 在基因组学的研究中，需要将基因组的DNA片段切割成较的片段进行测序，以此来提高测序的速度。但我们前面提到的载体一般都无法满足这一需要，为了达到这一目的，人们开发出了酵母人工染色体(YAC)和细菌人工染色体(BAC)，前者可容纳100万个碱基的DNA片段，后者可容纳30万个碱基的D