10生物技术制药第3章基因工程制药 教学精品.ppt

1、表达载体 从大肠杆菌中制备质粒要比从酵母中容易得多，因此酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的，只有在最后阶段在转入酵母中 酵母载体有两类：普通表达载体和精确表达载体。 普通表达载体，只能方便地引入外源基因并进行表达，对表达产物的组成，特别是对其氮末端氨基酸是否有增减并无严格要求。 精确表达载体，使它在表达和加工后氮末端氨基酸序列与天然产物相同，既无多余的氨基酸，也无缺失的氨基酸。 2、影响目的基因在酵母菌中表达的因素 （1）、外源基因的拷贝数 （2）、外源基因的表达效率 （3）、外源蛋白的糖基化 （4）、宿主菌株的影响 （1）、外源基因的拷贝数 拷贝数要适当，高拷贝数的质粒载体可使外源基因高效表达，但会引起细胞生长量的降低，单拷贝的质粒载体对细胞的最大生长没有影响，能达到较高效的表达。 （2）、外源基因的表达效率 与启动子、分泌信号、终止序列有关。要使外源基因在酵母中表达必须将外源基因克隆到酵母菌表达载体的启动子和终止子之间，构成表达框架。 （3）、外源蛋白的糖基化 外源蛋白在酵母细胞中可以发生糖基化，与哺乳动物中发生的糖基化相同，所得产物与天然产物相同。 （4）、宿主菌株的影响 宿主菌株应具备下列要求： 菌体生长力强； 菌体内源蛋白酶要较弱； 菌体性能稳定； 分泌能力强。 第五节 基因工程菌的稳定性 基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，有分裂不稳定和结构不稳定。 分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象； 质粒结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。 一、质粒不稳定产生的原因 常见的是分裂不稳定，与两个因素有关： 一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率； 二是这两种菌的比生长速率差异的大小。 由ln(Xt/Xo)=ut得,比生长速率u=ln(Xt/Xo) / t.理论上Xo为接种后的细胞浓度,Xt为发酵t小时的细胞浓度 u=dx/dt/x，即单位细胞浓度的细胞增长速率，其量纲为1/t，一般单位用1/h。 比生长速率是菌体生长速率与培养基中菌体浓度之比 含低拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较大，增加工程菌中的质粒拷贝数能提高质粒的稳定性。 含高拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低，但是大量外源质粒的存在使含质粒菌的生长速率明显低于不含质粒菌，而不含质粒菌一旦产生，能较快地取代含质粒菌而成为优势菌，因而对这类菌进一步提高质粒拷贝数反而会增加含质粒菌的生长负势。 质粒稳定性的分析方法： 将工程菌培养液样品适当稀释，均匀涂布于不含抗性标记抗生素的平板培养基上，培养10-12小时，然后随机挑出100个菌落接种到含抗性标记抗生素的平板上，培养10-12小时，统计长出的菌落数，每一样品应取3次重复的结果，计算出比值，该比值反映了质粒的稳定性。 二、提高质粒稳定性的方法 1、采用两阶段法，第一阶段先使菌体生长至一定密度，第二阶段诱导外源基因的表达。 2、在培养基中加入选择性压力如抗生素等，以抑制质粒丢失菌的生长。 3、适当的操作方式也可使工程菌生长速率具有优势，调控温度、pH、培养基组分、溶解氧，通过间歇供氧和改变稀释速率都可以提高质粒的稳定性。 第六节 基因工程菌生长代谢的特点 菌体生长是菌体各成分尤其是生物大分子—核酸和蛋白质的综合表现，通常用比生长速率来表示。 对菌体生长的调控主要有两种观点： 1、能量的供应决定了菌体的最大比生长速率； 2、小分子前体和催化组分（RNA聚合酶、核糖体）的限制决定了菌体的最大比生长速率。 这两种观点分别从能量和合成反应的前体这两个不同的角度研究菌体的生长。 一、菌体生长与能量的关系 菌体生长是由呼吸控制的，各种碳源通过有限的呼吸能力所提供的最大能量决定了菌体在这种培养基中的最大比生长速率。 翻译-密码子 mRNA上三个相邻核苷为一组密码子. 第四节 基因表达 基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。 进行基因表达，我们所关心的是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性，产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。 一、宿主细胞的选择 二、大肠杆菌中的基因表达 三、酵母中的基因表达 第四节 基因表达 一、宿主细胞的选择 宿主细胞应满足以下要求：1、容易获得较高浓度的细胞；2、能利用廉价易得的原料；3、不致病、不产生内毒素；4、发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；5、容易进行代谢调控；6、容易进行DNA重组技术操作；7、产物的产量、产率高，产物容易提取。 宿主可分为两大类 原核细胞—大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌； 真核细胞—酵母菌、丝状真菌、哺乳动物细胞。 1、原核细胞 （1）、大肠杆菌 生长迅速、对其研究比较深入，所以常用，特点：表达基因工程产物的形式多种多样，有细胞内不溶性表