动物细胞工程--第四章-动物干细胞.pptVIP

第四章 动物干细胞 第一节 干细胞的概念和分类 一、概念 形态特征：圆形或椭圆形，体积小，核质比大； 生化特征：较高的端粒酶活性；一般都有独特的表 面标志； 增殖特征: 自稳定性：单细胞或无脊椎动物——不对称分裂 哺乳动物——种群意义上的不对称分裂 分化特征：是干细胞最重要的特征。干细胞本生不 是终末分化细胞，具有再分化的潜力。 二、分类 一）根据发生来源分类 胚胎干细胞： 成体干细胞： ESC 什么是畸胎瘤 如果在胚胎不同时期，某些多能细胞从整体上分离或脱落下来，使细胞基因发生突变，分化异常，则可发生胚胎异常。 一般认为，这种分离或脱落发生于胚胎早 期，则形成畸胎；而如发生于胚胎后期，则形成了具有内胚层、中胚层和外胚层三个胚层的异常分化组织，即形成了畸胎瘤。 鼻咽畸胎瘤 生殖嵴与PGC（原始生殖细胞） 成体干细胞：神经干细胞 二）根据分化潜能分类 全能干细胞：如ESC 多能干细胞：如造血干细胞、间充质干细胞 定向祖细胞：如造血母细胞等。 专能干细胞：皮肤干细胞，成肌细胞等 三）根据干细胞存在的组织器官分类 胚胎干细胞 造血干细胞 神经干细胞 肝脏干细胞 皮肤干细胞 肌肉干细胞等 第二节 胚胎干细胞 通过建立体外培养的方法，获得保持增殖且不分化的胚胎干细胞系的技术称为胚胎干细胞的建系。 一、胚胎来源的干细胞系（p132 图6-1） 1. 囊胚阶段的内细胞团（ICM） 2. 来源于生殖嵴部位的原始生殖细胞（PGC） 3. 来源于畸胎瘤组织（EC） 二、胚胎干细胞的建系 主要步骤包括： 1. 培养体系的选择和准备 2. 胚胎采集 3. ICM的获取 4. ICM的离散 5. ESC的建系 1. 培养体系的选择和准备 饲养层细胞的准备： 饲养层细胞一方面对ESC细胞帖壁起支持作用，另一方面其分泌蛋白可抑制ESC分化，维持其增殖特性和多能性。 常用饲养层细胞为成纤维细胞（如STO成纤维细胞系）、子宫内皮细胞、3T3细胞株等。 为了阻断饲养层细胞的分裂，而不影响其分泌蛋白的产生，通常采用γ射线或丝裂霉素C处理之。 培养基的准备： 用DMEM（高糖）培养液，其中胎牛血清的浓度和质量很重要，还要加非必须氨基酸；β-巯基乙醇。 常采用添加LIF等抑制ESC的分化潜能；添加EGF等生长因子来促进ESC的增殖。 LIF抑止胚胎干细胞分化的信号通路 LIF 干细胞表面的LIF受体和gp130蛋白形成异二聚体 激活JAK酪氨酸激酶系统 激活MAP激酶ERK级联反应和STAT3蛋白 STAT3形成同型二聚体入核 激活核内靶基因转录 表达相应蛋白抑止ESC的分化 2. 胚胎的采集 一般囊胚期胚胎或后桑葚胚。 3. ICM的获取 1）直接分离法：囊胚于饲养层上自行发育成孵化囊胚，待ICM扩大增殖时挑取。或使用链霉蛋白酶处理ZP，获得裸胚培养。 2）免疫分离法：链霉蛋白酶去除囊胚晚期胚泡ZP，依次转移至补体灭活和未灭活的抗血清中，去除滋胚层细胞后，吸取ICM，移至饲养层培养。 4. ICM的离散 胰蛋白酶消化即可离散ICM。 5. 胚胎干细胞建系 三、胚胎干细胞的应用 第三节、胚胎干细胞的生物学特性与鉴定方法 一、生物学特性 增殖与分化特征： 永生化(immortal)； 能维持稳定的正常的二倍体染色体结构； 有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化； 能参与胎儿所有组织的发育过程； 形态特征 体积小、核大，有一个或多个核仁； 胚胎干细胞克隆紧密堆积，细胞之间无明显的界限，细胞克隆有一定形状规律。 生化特征 具有碱性磷酸酶和端粒酶活性； 表达SSEA-3