- 1、本文档共6页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
- 5、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
- 6、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 7、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 8、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
慢病毒载体包装构建过程.
慢病毒载体包装构建过程
原理:慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染
色体上,从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效
地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞
等多种类型的细胞,从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转
染的细胞, 如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,使用慢病毒载
体,能大大提高目的基因或目的shRNA 的转导效率,且目的基因或目的
shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加,能够比较方便快捷地实
现目的基因或目的shRNA 的长期、稳定表达。
概念:慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒
载体,慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息,是
慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病
毒包装质粒、细胞系的辅助下,经过病毒包装成为有感染力的病毒颗
粒,通过感染细胞或活体组织,实现外源基因在细胞或活体组织中表
达。
辅助成分:慢病毒载体辅助成分包括: 慢病毒包装质粒和可产生病毒
颗粒的细胞系。
慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包
装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有
辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒,需要利用表达载体和包装质粒同
时共转染细胞,在细胞中进行病毒的包装,包装好的假病毒颗粒分泌到
细胞外的培养基中,离心取得上清液后,可以直接用于宿主细胞的感
染,目的基因进入到宿主细胞之后,经过反转录,整合到基因组,从而
高水平的表达效应分子。
基本原理:慢病毒载体系统由两部分组成,即包装成分和载体成分。
包装成分:由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用
序列而构建,能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常
被分开构建到两个质粒上,一个质粒表达Gag和Pol蛋白,另一个质粒表
达Env蛋白,其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与
载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞),即可在细胞上清中收
获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗
粒。
载体成分:与包装成分互补,即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺
式作用序列,同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入
的目的基因。
为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能,需尽量减少二者的
同源性,如将包装成分上5ʹLT R换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、
3ʹLT R换成SV40 polyA等。
一、 实验流程 (1和2为并列步骤)
1.慢病毒过表达质粒载体的构建
设计上下游特异性扩增引物,同时引入酶切位点,PCR(采用高保真KOD
酶,3K 内突变率为0%)从模板中 (CDNA质粒或者文库)调取目的基因
CDS 区 (coding sequence )连入T载体。将CDS 区从T载体上切下,装入慢
病毒过表达质粒载体。
2.慢病毒干扰质粒载体的构建
合成siRNA对应的DNA颈环结构,退火后连入慢病毒干扰质粒载体
3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化
制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒,三种质粒载体分别进
行高纯度无内毒素抽提,共转染293T细胞,转染后6 h 更换为完全培养
基,培养24和48h后,分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,病毒上
清液通过超离心浓缩病毒。
二、实验材料
2.1慢病毒载体、包装细胞和菌株
该病毒包装系统为三质粒系统,组成为pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-
ZsGreen1/pLVX-shRNA2 。其中质粒上的ZsGreen1表达框能表达绿色荧光
蛋白 (GFP)。
载体信息
1) 慢病毒克隆载体图谱如下:
2 ) 包装质粒信息如下:
PMD2G载体图谱和序列信息
PSPAX2载体图谱和序列信息:
细胞株 293T ,慢病毒的包装细胞,为贴壁依赖型成上皮样细胞,生长
培养基为DMEM(含10% FBS) 。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
菌株大肠杆菌菌株DH5α 。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
三、流程图
文档评论(0)