乙肝表面抗原定量测定地方法学验证.docVIP

实用标准文案 文档 乙肝表面抗原的ELISA法定量分析 方法学验证 姓名 Z P 学号 0925400072 班级 09级医学检验本科二班 指导老师 沈 富 兵 二〇一三年四月乙肝表面抗原定量测定的方法学验证 作者：ZP（成都医学院检验医学院09级医学检验本科二班，610500） 【摘要】? 目的 用福州蓝图生物工程有限公司出品的乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒对乙肝表面抗原定量测定的方法进行验证，以判断是否能用于教学以及临床分析。方法 运用ELLISA法定量测定乙肝表面抗原，应用试剂盒HBsAg标准从浓度为8ng/ml的2倍稀释的6个浓度梯度，根据OD值绘制标准曲线再计算相对回收率和板内和板间精密度，通过资料数据综合分析。结果 HBsAg线性较好，其准确度、精密度、LOD值均在正常范内。结论 ELISA法定量检测HBsAg能较准确、快速地反映体内乙肝病毒复制情况，可以用于教学以及临床分析。 【关键词】? 乙肝表面抗原 方法学验证 标准曲线 精密度 ELLISA 病毒性肝炎中乙型肝炎的危害较大，我国是病毒性乙型肝炎的高发流行区，普通人群的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染率接近60％，约占世界HBV携带者的1/3。乙型肝炎病毒的病原体不仅具有传染性，还可能导致发展成肝硬化，甚至肝癌，所以乙型肝炎病毒的早期、准确、定量检测对乙型肝炎临床诊断、疗效观察及预防具有重要的意义。酶免分析法HBV—EIA是HBV抗原和抗体最常用的检测技术，其方法简便、价廉，适合一般实验室推广，其中酶联免疫吸附技术(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)目前应用最为广泛，它常用聚苯乙烯为固相载体，使其与待测标本中的相应抗体或抗原结合，然后加酶标记的抗原或抗体，再加底物显色，最后根据色泽深浅来推算待测抗原或抗体的含量。此方法特异性高，有效测定范围可达到20500 ng/ml，且酶免疫法有标记的试剂比较稳定并且无放射线危害等优点。 我们采用对已知抗体浓度的样品进行ELISA的定量检测，通过对其数据的分析来验证ELISA法最乙肝表面抗原定量检测的准确性和可靠性，以衡量其实用性。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂盒 乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品。1.1.2 仪器及酶标板 酶标仪：Bio-Rad 680；洗板机：Bio-Rad 1575；超纯水系统：Millipore Elix；电热恒温培养箱(DNP-9052):上海精宏实验设备有限公司。 1.1.3 溶液配制 = 1 \* GB2 \* MERGEFORMAT ⑴0.01M pH7.4的PBS缓冲液： 称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4, 溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。 = 2 \* GB2 \* MERGEFORMAT ⑵质控品： 用PBS缓冲液将标准品配制成6、3、1.5ng/ml三个质控品，每质控品1ml。首先取450μl的8ng/ml的标准品到C1号EP管中再向其中加入150μl的PBS缓冲液，即配制成了6ng/ml的质控品，再取300μl C1号EP管内的溶液到C2号EP管内，再向C2号管内加入300μl的缓冲液混匀。即配制成了3ng/ml的质控品。接着取300μl C2号管内的液体到C3号EP管内，再加入300μl的缓冲液混匀，即配制成了1.5ng/ml的质控品。具体方法如下图1 C23 C2 3ng/ml C1 C1 6ng/ml C3 1.5ng/ml 图1 1.2 检测方法 1.2.1 标准曲线各浓度的配制 = 1 \* GB2 \* MERGEFORMAT ⑴用PBS缓冲液将标准品配制成8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml。 = 2 \* GB2 \* MERGEFORMAT ⑵先取6个EP管分别标记为对应的浓度。 = 3 \* GB2 \* MERGEFORMAT ⑶取400μl标准品于标记为?的EP管中，再取200μl?号管内液体于?号管内再向?号管中加入200μl的缓冲液混匀，即配制成了浓度为4ng/ml的标准品。 = 4 \* GB2 \* MERGEFORMAT