大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备.docxVIP

3.大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备 　　　 电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，同时，DNA在电场力的作用下进入细胞，随后细胞复苏和弥合，从而实现质粒DNA的物理转移。为避免电击时出现“击穿”，即产生电流，细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为109～1010 转化子/μg DNA。 3.1．感受态细胞的制备 （1）感受态细胞及材料准备同钙转化感受态细胞的制备相同。 （2）选合适的大肠杆菌在4℃，3000 rpm下离心10min，弃上清液（如需要，沉淀可在4℃的10%甘油中保存1～2天）。 （3）弃上清，离心管中加入少量ddH2O，轻柔的悬浮沉淀后，再将水注满离心杯，4℃，3000 rpm离心10min。 （4）重复步骤（3）1次。 （5）小心弃上清（沉淀可能会很松散），再往离心管中加入少量10%甘油（灭菌，预冷），重悬菌体，再加满10%甘油，4℃，4000 rpm离心10min。 （6）用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2～3ml，将细胞按200μl等份装入微量离心管，放置于－80℃下保存。 （7）按照钙转化感受态细胞方法进行转化效率和抗性检测。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 3.2．电转化 为了降低离子浓度，待转化的质粒DNA，如质粒或酶连产物，在电转化前应该进行纯化（乙醇沉淀），以下所有步骤都需要保持无菌操作。 （1）从－80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；加入待转化的质粒DNA，冰浴10min；同时将电转化杯进行冰浴。实际操作中，如果电转化杯浸泡在乙醇中，可提前取出电转化杯，在无菌的超净台上吹干。 （2）打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。特别注意，不同的电转化杯，所使用的电压不同。防止电压不够，难以有效转化，以及，电压过高，击爆电转化杯，产生火花，产生危险。 （3）将冰浴后的感受态细胞（含DNA）转移到电转化杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部（注意：其体积以填充电转化杯到电极之间空间即可，具体的用量可参见具体所使用的电转化杯的说明）。 （4）将电极杯推入电转化仪中，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入800μl的LB液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。 （5）37℃，220～250 rpm复苏40min。 （6）按照钙转步骤进行涂板培养。 【电击杯清洗流程】 （1）用清水将电击杯稍冲一下。 （2）向电击杯中加入75%酒精浸泡2h。 （3）去酒精，再用蒸馏水冲洗2～3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。 （4）加入无水乙醇2ml于电击杯中，浸泡30min。 （5）去无水乙醇，于通风厨内挥发干乙醇。 （6）将清洗好的电击杯放入－20℃冰箱内待用。 【注意】不同样品使用的电转化杯应分开；若长期不用，应将清洗好的电转化杯浸泡在乙醇中。