种子淀粉酶测定方法.doc

淀粉酶活力的测定一、目的学习和掌握测定淀粉酶（包括α-淀粉酶和β-淀粉酶）活力的原理和方法。二、原理 淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。 淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。 淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化。β-淀粉酶不耐热，在70℃15min钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（α-淀粉酶活力+β-淀粉酶活力），再减去α-淀粉酶的活力，就可求出β-淀粉酶的活力。三、试剂（1）标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解定容至100mL。（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20mL 2mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100mL。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用。（3）0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液??A液：（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7?H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L。B液：（0.1mol/L柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7?2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。取A液55mL与B液145mL混匀，既为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液。（4）1%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。四、操作步骤1．麦芽糖标准曲线的制作取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表1加入试剂： 试剂 管号 1 2 3 4 5 6 7 麦芽糖标准液/mL 0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 蒸馏水/mL 2.0 1.8 1.4 1.0 0.6 0.2 0 麦芽糖含量/mg 0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 3,5二硝基水杨酸/mL 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20mL。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度。以麦芽糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。2．淀粉酶液的制备 称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加入少量石英砂和2mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15～20min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3000r/min转速下离心10min，将上清液倒入100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液，用于α-淀粉酶活力测定。 吸取上述淀粉酶原液10mL，放入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶总活力的测定。2． 酶活力的测定：取6支干净的试管，编号，按表2进行操作。?酶活力测定取样表 操作项目? β-淀粉酶活力测定 ??β-淀粉酶活力测定 Ⅰ- 1? Ⅰ- 2 Ⅰ- 3? Ⅱ- 4 Ⅱ- 5 Ⅱ- 6 淀粉酶原液（mL） 1 1 1 0 0 0 钝化β-淀粉酶? ? 置70℃水浴15min，冷却 淀粉酶稀释液（mL） 0 0 0 1 1 1 3,5二硝基水杨酸/mL 2 0 0 2 0 0 预保温 将各试管和淀粉溶液置于40℃恒温水浴中保温10min 1%淀粉溶液（mL） 1 1 1 1 1 1 保温 在40℃恒温水浴中准确保温5min 3,5-二硝基水杨酸mL 0 2 2 0 2 2 将各试管摇匀，显色后进行比色测定光密度，记录测定结果，操作同标准曲线。五、结果计算计算Ⅰ- 2、Ⅰ- 3光密度平均值与Ⅰ- 1光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（