海洋细菌ZC1中GH50家族琼胶酶的研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

汕头大学硕士学位论文 汕头大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 摘 要 本课题组前期从汕头南澳海域的一株紫菜藻体上分离到一株高效琼胶降解 菌株 Aquimarina agarilytica ZC1，并完成了该菌的全基因组测序，BLAST 结果 显示该菌具有 40 个可能的琼胶酶基因，其中有 18 个属于 GH16 家族，11 个属 于 GH86 家族，3 个属于 GH50 家族，1 个属于 GH117 家族，其余 7 个未搜索到 GH 家族保守区。 通过构建琼胶酶氨基酸序列的系统进化树，发现其中琼胶酶 573、575 和 576 属于糖苷水解酶 GH50 家族，琼胶酶基因 573 包含 2325bp，编码 774 个氨基酸， 预测其分子量为 87.9KDa，等电点为 7.35；琼胶酶基因 575 包含 2085bp，编码 694 个氨基酸，预测其分子量为 78.6KDa，等电点为 8.38；琼胶酶基因 576 包含 2139bp，编码 712 个氨基酸，预测其分子量为 81.4KDa，等电点为 7.05。使用 pET-32a(+)载体构建基因的表达载体，将重组质粒转入表达宿主 Escherichia coli Rosetta(DE3)中，成功构建重组表达工程菌，终浓度为 0.1mM 的 IPTG，16℃诱 导 24h。通过 SDS及 Western-blotting 证实了重组酶在宿主中的大量表达。 通过镍柱亲和层析纯化得到重组琼胶酶 573、575 和 576，并达到了电泳纯。通 过 DNS 法测定琼胶酶活性发现，仅重组酶 575 和 576 具有琼胶酶活性，而重组 酶 573 没有琼胶酶活性。通过对琼胶酶催化模块基因 C573、C575 和 C576 进行 克隆和重组表达，发现保守区基因的表达产物均不具有琼胶酶的活性，并且没有 表现出对琼脂糖的绑定作用。 对重组酶的酶学性质研究发现：重组酶 575 在温度为 37℃～40℃之间以及 在 pH 为 6.0～10.0 之间具有较高的酶活力，其中在温度为 37℃、pH 为 8.0 时酶 活力最高，同时该酶在温度小于 40℃以及 pH 在 5.0～10.0 之间表现稳定。金属 离子 Ca2+对 575 酶活性有很强的促进作用，在浓度为 50mM 的条件下琼胶酶 575 的活力提高了 136%；重金属离子 Al3+以及 EDTA-Na2、SDS 会抑制琼胶酶 575 的活性。其降解琼脂糖的 Vmax 和 Km 值分别为 8.27×10-5mol·L-1·min-1 和 0.0133mol·L-1。重组酶 576 在温度为 37℃、pH 为 6.0 时酶活力最高；尿素、 EDTA-Na2 和金属离子 Na+、K+、Fe3+对重组酶 576 活性几乎没有影响；SDS 和 金属离子 Mg2+、Ca2+、Al3+严重抑制重组酶 576 的活性；其降解琼脂糖的 Vmax I 和 Km 值分别为 6.22×10-5mol·L-1·min-1， Km 值为 0.0132mol·L-1。 采用 13C-NMR 对重组琼胶酶降解琼脂糖终产物进行进一步的分析，图谱显 示位于 97ppm 与 93ppm 处存在响应峰，而 90.7ppm 处无共振响应，由此确定重 组酶为 β-琼胶酶。通过 TLC 对重组酶 575 和 576 降解琼脂糖和新琼寡糖产物进 行分析，其终产物是新琼二糖。最终我们得出结论：重组酶 575 和 576 均属于 GH50 家族，为外切型的 β-琼胶酶，二者降解琼脂糖和新琼寡糖的唯一产物均是 新琼二糖，这在国际上鲜有报道。 通过系统进化树发现，琼胶酶 852 与 GH117 家族的 α-新琼二糖水解酶相似 性很高，将重组酶 852 与已经报道的新琼寡糖水解酶进行氨基酸序列比对，该酶 852 具有 GH117 家族的催化活性部位的保守氨基酸。通过对该基因进行克隆和 表达，进一步验证了 852 属于 GH117 家族的一个成员，并且能够将新琼二糖降 解为 β-D-半乳糖和 3,6-酐-α-L-半乳糖。 关键词：Aquimarina agarilytica ZC1，GH50 家族琼胶酶，新琼二糖，新琼寡糖 水解酶 II Abstract An agar-degrading bacterium, Aquimarina agarilytica ZC1 was previously isolated from the Laver in the sea area of Nan’ao in the city of Shoutou, and its genome sequencing had been completed. According to BLAST results, it can be in