蛋白质的分离、纯化和鉴定.pptVIP

3-11 蛋白质的分离、纯化和鉴定 一、细胞破碎 动物细胞：电动捣碎机、匀浆器、超声波破碎法 植物组织：匀浆器、石英砂研磨 微生物：溶菌酶+超声波 二、抽提 选择合适的溶剂 避免目的蛋白质的变性 在低温下进行 三、分离 盐析法：常用硫酸铵、氯化钠、硫酸钠、硫酸镁等。特点为安全、简便、分辨率不高 有机溶剂沉淀法：常用丙酮和乙醇。特点为分辨率稍高，高浓度溶剂易引起变性 等电点沉淀法：蛋白质能保持天然构象和活性、沉淀不完全 吸附法：常用硅胶、活性炭、氧化铝等。适用于处理大量样品 超滤法 四、纯化 1、离子交换层析 2、凝胶过滤 原理：根据蛋白质分子大小的不同进行分离 介质特点：内部多孔的网状结构 常用的凝胶：葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶 优点：分离条件温和，不影响样品的生物活性；样品损失小，回收率高。 习题 指出下列蛋白质通过凝胶过滤层析柱（蛋白质分离范围从5000到400000）时的洗脱顺序。 肌红蛋白：16900； 过氧化氢酶：247500； 细胞色素C：13370； 肌球蛋白：524800； 胰凝乳蛋白酶原：23240； 血清清蛋白：68500。 3、疏水作用层析 原理：利用蛋白质表面的非极性基团和介质上的疏水基团间的疏水作用来分离蛋白质的层析方法。 介质：以琼脂糖为母体，偶联上非极性基团。如苯基琼脂糖、辛基琼脂糖等。 洗脱：高离子强度增加疏水作用。高浓度硫酸铵存在下将蛋白质吸附在介质上，然后逐渐降低硫酸铵的浓度进行洗脱。 4、亲和层析 原理：根据蛋白质能与特异的配体相结合而设计的方法。如抗体与抗原、激素与受体、酶与底物、酶与抑制剂等。 五、鉴定 1、纯度鉴定：电泳法、HPLC法 2、相对分子质量的测定：超离心法、凝胶过滤法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 3、等电点的测定 4、生物活性的测定 巯基乙醇：破坏-S-S- 电泳过程 蛋白质电泳迁移率取决于相对分子质量，与其所带电荷和分子形状无关 Log Mr=a – bμ μ=样品迁移距离/前沿迁移距离 SDS：变性剂破坏分子中的-H和疏水作用。改变蛋白质的带电状态、改变蛋白质单体分子构象。 六、蛋白质含量的测定 总蛋白含量分析：凯氏定氮法、Folin-酚法（Lowry法）、双缩脲法、考马斯亮蓝法、紫外吸收法 特定蛋白组分的含量分析：酶、激素等测定活性 三聚氰胺 结构 用途：广泛应用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业 根据美国食物及药物管理局的标准，三聚氰胺可容忍摄入量为每日0.63毫克/公斤体重 假蛋白原理：蛋白质主要由氨基酸组成，其含氮量一般不超过30%，而三聚氰胺的分子中含氮量为66％左右。通用的蛋白质测试方法“凯氏定氮法”是通过测出含氮量来估算蛋白质含量，因此，添加三聚氰胺会使得食品的蛋白质测试含量偏高，从而使劣质食品通过食品检验机构的测试。 本章主要内容 氨基酸 肽 蛋白质的结构、重要性质、结构与功能关系和蛋白质的分离纯化 　Folin—酚试剂法（Lowry法）  　　（一）实验原理 　　这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是：?在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。 　　Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。 　　进行测定时，加F olin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷