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PCR引物设计方法和原理 一、引物设计的目的 获得目标片段 DNA测序 基因克隆 体外转录 突变 探针设计 分子标记 二、引物设计的类型 常规PCR引物 PCR同源引物和简并引物 探针 引物设计的步骤 下载DNA模板或蛋白质序列 进行同源比较，找到保守同源序列 设计引物 四、PCR引物设计的原则 引物长度（primer length）: 18-27 bp GC钳(GC clamp}: 引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加 3’末端碱基（3’End Sequence）: ＧＣＴ Tm 值(melting temperature) ：52~60℃ GC 含量（composition） ：40-60% 四、PCR引物设计的原则 ?G 值是指DNA 双链形成所需的自由能(internal stability, 用?G 值反映) :选用3’端?G 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间?G 值相对较高的引物 引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值 :超过4.5kcal/mol易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行 引物的修饰 :一般是在5’端增加酶切位点 Breslauer,邻近法的相邻核苷酸的动力学数值(自由能)来预测双链稳定性 五、简并引物的设计 　五、同源引物设计 六、网络免费在线引物设计软件 六、引物设计常用商业软件包 七、Primer Premier和Oligo引物软件使用方法 常有引物设计软件的引物的自动搜索和评价分析 软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以“Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索功能以“Premier Primer”为最强且方便使用，“Oligo 6”其次，其他软件如“Vector NTI Suit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo”进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。 * *