含hTK1和hTIMP1双基因载体的构建及在大鼠血管平滑肌细胞的表达-老年医学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 10 中文摘要 含 hTK1 和 hTIMP1 双基因载体的构建及在大鼠 血管平滑肌细胞的表达 目的 据研究表明，基质金属蛋白酶组织抑制物 1（TIMP1）对细胞外基质形成具 有重要作用；本课题前期研究发现含人组织激肽释放酶 1（ hTK1）基因过表达 具有部分抑制血管平滑肌细胞增殖和改善血管再狭窄的作用，但两者联合应用时 对血管平滑肌细胞增殖、迁移及血管重塑是否具有协同效应或叠加效应，目前尚 未明了。本课题首先构建含基因 hTK1 和 hTIMP1 双基因共表达的重组腺病毒载 体，并观察目的基因在大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）中表达情况。 方法 第一部分 1. 购买含 hTIMP1 基因的原始质粒，经鉴定其正确性后，采用酶切、PCR 扩增及产物回收、连接酶切产物，经热休克等克隆构建含强绿色荧光蛋 白（EGFP）和 hTIMP1 的重组穿梭质粒，并鉴定其正确性。 2. 选择相应内切酶位点，对含 hTIMP1 基因的重组质粒和 pDC316-hTK1 质粒 （本研究室保存）进行酶切并扩增目的基因片段，将两者 PCR 产 物回收、连接、热休克法转染感受态大肠杆菌和挑取克隆，构建含 hTK1 和 hTIMP1 双基因的重组质粒，经 PCR、酶切分析和测序方法鉴定其正 确性。 3. 将重组质粒线性化，并同骨架病毒质粒 pBHGloxE1,3Cre 于 293A 细胞 中包装，经包装获得重组腺病毒，用 TICD50 法测定病毒滴度。 第二部分 1. 采 用 组 织 贴 块 法 原 代 培 养 来 自 Sprague-Dawley (SD) 大 鼠 胸 主 动 脉 VSMCs，经鉴定后，选取 3-5 代细胞进行实 验。用三种重组腺病 毒 （Ad5-EGFP、 Ad5-hTIMP1-EGFP 与 Ad5-hTK1-hTIMP1 ）感染细胞， 分别以不同感染复数（MOI）和不同感染时间，观察目的基因的表达情 况。 2. Real-Time PCR 法测目的基因的转录水平表达。 Western Blot 法检测目的蛋白表达。 4. 细胞免疫荧光法检测目的蛋白表达。 结果 1. 经 PCR、酶切和测序分析结果，重组质粒 pDC316-hTIMP1-EGFP 和 pDC316- hTK1-hTIMP1 构建正确，在 293A 细胞中成功包装重组腺病毒 Ad5-hTIMP1-EGFP 和 Ad5-hTK1-hTIMP1, 其滴度分别为 7.0 × 1011 vp/ml 和 8.5×1011 vp/ml。 Ad5-hTIMP1-EGFP 和 Ad5-hTK1-hTIMP1 感染 VSMCs 后，Real-Time PCR 法检测目的基因 hTIMP1 及 hTK1-hTIMP1 的 mRNA 水平呈现高 表达，并呈现感染复数（50-150MOI）和时间（1-3d）依赖性增加。 Ad5-hTIMP1-EGFP 和 Ad5-hTK1-hTIMP1 感染 VSMCs 后，Wester-blot 法检测目的基因 hTIMP1 及 hTK1-hTIMP1 的蛋白呈现高表达，并呈现 感染复数（50-100MOI）依赖性增加。 Ad5-hTIMP1-EGFP 和 Ad5-hTK1-hTIMP1 感染 VSMCs 后，细胞免疫荧 光方法检测发现目的基因 hTIMP1 及 hTK1-hTIMP1 的蛋白呈现表达。 红色标记为目的基因蛋白在细胞中的表达, 蓝色标记为细胞核染色。 结论 1. 采用双启动子 CMV 策略，首次成功构建并包装了含 hTK1 和 hTIMP1 双基因共表达的重组腺病毒载体 Ad5-hTK1-hTIMP1，病毒滴度为 7.0× 1011 vp/ml。 2. 双基因重组腺病毒载体感染大鼠 VSMCs 后，检测到目的基因转录水平 及蛋白水平呈现独立高表达。 关键词 人组织激肽释放酶-1，人基质金属蛋白酶组织抑制物-1，血管平滑肌细 胞，重组腺病毒载体，基因表达 Abstract Consruction of Human Tissue Kallikrein 1 and Inhibitor of Metalloproteinases 1 Gene mediated by Recombinant Adenovirus Vector and expression on Rat Vascular Smooth Muscle Cells Objectives The studies shows that tissue inhibitor of matrix metalloproteinase (TIMP1) plays an important role in the extracellular matrix formation