利用GAP启动子在毕赤酵母中组成型表达人鹅型溶菌酶2.PDF

利用GAP 启动子在毕赤酵母中组成型表达人鹅型溶菌酶2* 1#** 2# 3 4 黄 鹏 闫丽萍 张宁 石金磊 （1 上海健康医学院临床医学院 上海201318） （2 青岛大学附属中心医院检验科 青岛266042） （3 上海健康医学院基础医学院 上海201318） （4 上海科技大学生命科学与技术学院 上海 201210） 摘要 利用甘油醛三磷酸脱氢酶 （glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase，GAP）启动子 1 在毕赤酵母中表达人鹅型溶菌酶2 （human goose-typelysozyme2，hLysG2），并在小试规模 v 7 4 建立一套有效的重组hLysG2 （recombinanthLysG2，rhLysG2）生产工艺流程。根据毕赤酵 2 0 0 母密码子偏爱性设计并人工合成hLysG2 基因，将其连接至pGAPZαA 质粒中，构建重组表 . 6 0 达质粒pGAPZαA-hLysG2。将重组表达载体线性化后电转化毕赤酵母GS115感受态细胞， 8 1 0 通过Zeocin 抗性筛选获取高拷贝重组菌株，并在5L 生物反应器中进行发酵培养。发酵60h 2 : v 后发酵液上清酶活性达到最高，发酵液上清经SDS及Westernblot检测证实rhLysG2 i X a 得到表达。与诱导型表达相比，组成型表达发酵时间缩短了48h，上清中rhLysG2 总活性提 n i h 高了23.8%；使用甲壳素亲和层析和分子筛层析对rhLysG2 进行纯化后，每升发酵液上清可 c 纯化到187.4mg 重组蛋白，纯化产物纯度达99.0%以上；浊度测定法分析显示，在pH 5.6、 + 30 ℃和0.1mol/LNa 的条件下，rhLysG2 可达到最大酶活性 13500U/mg。利用GAP 启动子 在毕赤酵母中成功表达了高纯度和高活性的rhLysG2，避免了甲醇的使用，缩短了发酵时间， 提高了蛋白产量，为将rhLysG2 开发为新型抗耐药菌药物奠定了基础。 关键词 人鹅型溶菌酶2 毕赤酵母 GAP 启动子 组成型表达 杀菌活性 中图分类号 R392-33，R392.11 1 :* (201740161); (15ZR1421800) 基金资助 上海市卫生计生委科研课题 上海市自然科学基金 # : , ;** : ,E-mail:huangp_15@ 并列第一作者 黄鹏 闫丽萍 通讯作者 黄鹏 1 ConstitutiveExpressionofHuman Goose-typeLysozyme2 inPichiapastoris UsingtheGAP Promoter 1 2 3 4 HUANGPeng YAN Li-ping ZHANGNing SHI Jin-lei (1College ofClinicalMedicine, ShanghaiUniversity ofMedi