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第10章 基因工程基础 第一节 基因工程概述 DNA克隆 克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷 贝的集合. 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning), 即无性繁殖. 技术水平: DNA克隆:分子克隆(molecular clone) 细胞克隆 个体克隆(动物或植物) DNA克隆: 应用酶学的方法,在体外将各种来源的DNA(同 源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的)与载 体DNA接合成一具有自我复制能力的分子—— 复制子(replicon),继而通过转化或转染宿主 细胞,筛选出含有目的基因的转化子,再进行 扩增提取获得大量同一DNA分子,也称基因克 隆或重组DNA(recombinant DNA). 第二节 目的基因的获得 一 目的基因的获得: 化学合成 聚合酶链式反应(PCR)方法扩增 建立基因组DNA文库 构建cDNA文库 化学合成法: 要求:1)已知目的基因的序列或其产物 的氨基酸序列 2)片段不宜太长 工具:自动化DNA合成仪 应用:1)合成PCR引物 2)寡核苷酸探针 3)人工接头序列及较小的基因 聚合酶链式反应(PCR)方法扩增 1985年美国科学家Mullis发明了聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术 PCR是应用最广的分子生物学技术之一,可用来快速在体外扩增DNA, PCR技术在临床检验和分子生物学中的应用十分广泛. PCR技术就是在体外的离心管中通过酶促反应有选择地大量扩增(包括分离)一段目的基因的技术,即体外进行DNA复制. 需要的物质:模板DNA,引物,dNTP(Mg2+),TaqDNA聚合酶 4种反应混合物经历变性、退火、延伸三步 94℃,热变性,双链解开 55℃,冷却退火,引物与模板的单链DNA 的特定互补部位相配对和结合 72℃,TaqDNA聚合酶作用下,新链延伸, 形成互补DNA双链 如此30个循环可获得230个基因片段 Taq DNA聚合酶(Taq DNA pol,Taq pol) 1969年在美国黄石公园温泉分离出一种嗜热真 菌,cetus公司首次分离纯化了该酶,分子量 94KD,该酶特点: 最适反应温度是75℃-80℃,能抵抗链分离所 需要的高温(94℃-95℃)的反复处理. 建立基因组DNA文库 基因组DNA文库: 分离供体细胞中的染色体DNA,酶切后,将这些染色体 DNA片段与某种载体相接,而后转入大肠杆菌,建立包 含有供体染色体DNA片段的克隆株, 特点:克隆株群体提供全套遗传信息,即完整的基因 组DNA 构建基因组文库过程: ⑴分离纯化基因组DNA ⑵制备全部基因组的DNA片段 ①机械断裂法(超声波或高速搅拌) 断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端, 因此插入载体之前还需要进行修饰加工,少用 ②限制性内切酶降解(鸟枪法)(常用Sau3A) 断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端, 可以直接与处理过的载体连接 ⑶DNA片断与载体的连接 常用载体:λ噬菌体 ⑷转化细菌 1个克隆含有基因组的某个片段,整个克隆群体就包 含基因组的全部基因片段总和. 构建cDNA文库 cDNA文库:以mRNA为模板在反转录酶的作用下将形 成的互补DNA(cDNA)建立基因文库. 特点: 无内含子,长度比基因组基因小,操作简单 mRNA比基因组中基因少,筛选基因工作量小 mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数, 利于获得较多的模板. 可在原核细胞中表达有生物活性蛋白 不同种类不同状态的细胞的cDNA文库不同 不能研究基因组的结构功能 构建cDNA文库过程: 1)制备mRNA. 先提取总RNA,再分离 mRNA.通过oligo(dT) 纤维素分离mRNA 2)第一股 cDNA合成 以Oligo(dT)为引物:从模板 3’末端开始,沿模板3’→5’方 向合成 随机引物:以6～8个核苷酸 为随机引物,从mRNA的不同 结合点合成全长cDNA第一链 3)第二股cDNA的合成 自身引导法 外加引物合成法 4)cDNA与载体连接和导入宿主细胞 第三节 分子克隆中常用的载体 一 质粒载体 1.质粒的基本特性 本质是细菌染色体以外的遗传物质,是一种简单的,能自主复制的环状DNA分子. 命名:前一个小写p代表质粒,后两个大写英文字母代表发现者或实验室,数字代表编号,如pBR322