免疫检测法课件.ppt

实验材料： 羊抗人血清白蛋白抗体（一抗） 已知含量的人血清白蛋白（作标准曲线） 待检人血清白蛋白 辣根过氧化物酶标记的驴抗羊抗体（二抗） 包被液CBS：PH9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液 洗板液或稀释液：PH7.4，0.01mol/L PBS 底物溶液：OPD-H2O2 终止液：2mol/L H2S04 酶标反应板（一条/人） 方法 适用于 竞争法测抗体 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检验特异性抗体 捕获包被法测抗体 主要用于 血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定 ABS-ELISA 法 ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA应用不多。 制备纯化抗原或抗体 制备抗原或抗体包备液包被微孔板 制备酶标记抗体或抗原 制备酶催化底物 终止液 1.加样：加待检样品0.05ml于已包被之反应孔中，置37℃孵育30分钟。 (设置空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔各加0.05ml对照标准)。 2.洗涤,新鲜配置洗涤液注满微孔, 停滞15秒弃去.重复5次. 3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.05ml。37℃孵育30分钟. 4.洗涤,新鲜配置洗涤液注满微孔, 停滞15秒弃去.重复5次. 5.加底物液显色：于各反应孔中加入底物A液和底物B液各0.05ml，置37℃孵育15分钟。 6.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 7.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。 固定OD值 包被抗原 抗原用包被液（CBS）稀释至合适浓度，加入到酶标板中，100μl/孔，放入湿盒中，4℃过夜。 次日，用洗板液洗板3次（将洗板液加入每孔，1min后倾去），以洗去未包被的游离抗原。 抗原100ul/孔 湿盒中，4℃过夜 酶标板 抗原与抗体的预孵育 制作标准曲线： 在稀释板中，用PBS倍比稀释标准抗原，每种浓度的抗原最终为50μl，分别在各抗原孔中加入250μl一定浓度的抗体，放入37℃恒温培养箱中30 min。 待测抗原： 取50μl未知浓度的抗原按照同上操作。 待测抗原50ul PBS 50ul 50ul 稀释液 50ul 50ul 100ul 标准抗原 250ul抗体 稀释板 37℃，30 min * 50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射性免疫（RIA）分析技术之后，70年代初又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 。它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术( immunoenzymatic techniques ) 的基础上发展起来的一种免疫测定技术 。 免疫标记技术（immunolabelling technique）: 是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。 特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位 分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定 免疫酶技术(enzyme immunoassay)： 是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。 就是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。 常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP) 碱性磷酸酶（AP）。 ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，