免疫组化的原理与操作.pptVIP

（三）免疫组化染色基本技术及注意事项 1．实验计划 根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。如Ab-I鼠抗人的抗体，与其他种属间无交叉，则不能用其他动物，而且Ab-Ⅱ必须是羊抗鼠，若 PAP法Ab-Ⅲ必须来源于鼠，否则不能连接成复合物 ② 若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差 异，在贴片方面最好贴于同一张载片上，否则无可比性。 ③ 选用的试剂可靠，货源充足，随时可取。 2．Ab稀释度 （如系购买的药盒有工作液和原液） （1）工作液：无须稀释 （2）原液： 应参照其提供的工作液浓度进行预试验 原液的保存（-20℃）冻存——应选最佳稀度冻存。 ③若工作浓度大于1∶500则要先将原液稀释十倍，而 后分装10μl/瓶→冻存（-20 ℃）于 冰箱备用。 （3）Ab浓度的选择 Ab浓度不可太高或太低，因为Ag-Ab结合需在一定 浓度范围内进行，若一方过剩则形成复合物小且少； 极过剩时已形成的复合物亦会解体而呈现假阴性。 ——并非Ab浓度越高越好。 3．Ab滴片技术 —— 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。 ［注意］滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能干片。 要领：甩净组织周围的水。 4．Ab孵育技术 （1）必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。 （2）温度与时间 4℃过夜（＞16h） 37℃ 1 h or 参考说明书 5．光镜控制显色方法 （1）室内操作：注意温度与时间的关系，室温 最宜5分钟。 （2）染色稍浅亦可拿出，脱水，封片后颜色可 加深。 ▲ 染色失败的几种原因： （1）所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性 对照在内。全部（－）原因可能： ① 染色未完全严格按照操作步骤进行； ② 漏加一种抗体，或抗体失效； ③ 缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性； ④ 底物中所加H2O2 量少或失效； ⑤ 复染或脱水剂使用不当 （2）所有切片均呈阳性反应，原因可能是： ① 切片在染色过程中抗体过浓，或干燥了。 ② 缓冲液配置中未加氯化钠和PH值不准确， 洗涤不彻底。 ③ 使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应 时间过长。 ④ 抗体温育的时间过长。 ⑤ H2O2 浓度过高，呈色速度过快。粘附剂太 厚。 （3）所有切片背景过深，原因可能是： ① 未加酶消化处理切片。 ② 切片或涂片过厚。 ③ 漂洗不够。 ④ 底物呈色反应过久。 ⑤ 蛋白质封闭不够或所用血清溶血。 ⑥ 使用全血清抗体稀释不够。 （4）阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。 最常见的原因是：标本的固定和处理不当。 * * Immunohistochemistry 概念：免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC) 是利用抗原抗体反应和组织化学呈色反应来检测组织和细胞中某种化学成分的一门技术,是传统的免疫学和组织化学相结合而发展起来的一门新兴学科，也叫原位免疫学（In situ immunology）。 特点或优点：（1）特异性强、灵敏度高； （2）可定性、定位、定量观察； （3）将形态学改变与功能和代谢变化结 合起来； 免疫组化概述 IHC不仅具有传统形态学（包括LM和EM水平）能对组织和细胞进行仔细、客观观察的优点（特别是经苏木精或伊红复染后），而且还克服了传统免疫学反应只能定性和定量（离体、液相），而不能定位的缺点。IHC则可在原位和固相对染色结果进行观察。目前IHC的定位可精确到亚微结构水平。 随着IHC技术的发展和图象分析技术的发展，IHC已进入多标记（双标记）和定量研究的阶段，使IHC在生物学和医学各领域的应用日益广泛，不仅用于研究，也用于诊断。IHC与核酸分子杂交相结合形成的原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）既特异性强、灵敏，又具定位、可视的特点。 —— IHC技术源于免疫荧光术（immunofluorescence, IF），从1941年~1950年Coons等用了10年首创了 荧光素标记抗体技术——检测肺组织内的肺炎双 球菌，六、七十年代IF在科研中占据着主导地位 ——1968