Q引物是如何合成的-鼎国生物.DOCVIP

引物合成常见问题 Q1.引物是如何合成的？ 目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。 (1) 去保护：加入Deblocking脱去碱基上5- OH的保护基团DMT，获得游离的5- OH； (2) 耦合：同时加入活化剂和新的碱基，新的碱基5-OH仍然被DMT保护，3端被活化与溶液中游离的5-OH发生耦合反应； (3) 封闭：耦合反应中极少数5- OH没有参加反应，用封闭试剂终止其后继续发生反应； (4) 氧化：加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。 Q2.引物合成如何处理？ 切割与脱保护基：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的3’羟基。 纯化：根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。常用的纯化方法有：C18、OPC、PAGE和HPLC。 定量：根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。 储存：分装抽干。 Q3.合成的引物5’端是否有磷酸化？ 合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5’端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5’或3’端进行磷酸化，需要另外收费。 Q4.需要什么级别的引物？ 根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。 应用 引物长度要求 纯度级别要求 一般PCR扩增 60base HEPD 60 base PAGE 诊断PCR扩增 40base HEPD, PAGE DNA测序 20base左右 HEPD 亚克隆，点突变等 根据实验要求定 HEPD, PAGE，HPLC 基因构建（全基因合成） 根据实验要求定 HEPDPAGE 反义核酸 根据实验要求定 HEPDPAGE 修饰引物 根据实验要求定 PAGE, HPLC Q5.需要合成多少OD数？ 根据实验目的确定。一般PCR扩增，2 OD引物，可以做500-1000次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。 Q6.如何计算引物的浓度？ 引物保存在高浓度的状况下比较稳定。一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成100pmol/ul，称为保存浓度，而引物的工作浓度一般配制成10-50pmol/ul。加水的体积（微升）可直接参照合成报告单上推荐的体积，也可按下列方式计算： V (微升)= OD数x 33 x 10000 /引物的分子量 引物的分子量可以从合成报告单上获得。注意：1 OD260= 33 ug/ml。 溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致。如果不一致，请和我们联系。我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。 Q7.如何计算引物的Tm值？ 引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成及所使用缓冲夜的离子强度有关。 长度为25base以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T) 对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为： Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (GC%) – 600/size＊ ＊公式中，Size =引物长度。 Q8.引物（含修饰）的分子量是如何确定的？ 非修饰的引物的分子量（MW）在随引物提供的报告单上可以找到。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数 x碱基的平均分子量，或按下列公式计算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod)＋(Nx * Wx)+( NI* WI) +16* Ns–62. NA, NG, NC, NT, NI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA, WG ,WC, WT, WI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod分别为修饰基团的数目和分子量。对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A混合的分子量为（313.21+329.21）/2 = 321.21。Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量16。 常规碱基分子量 Base Molecular Weight A 313.21 C 289.18 G 329.21 T 304.19 I 314.2 U 290.17 常规修饰基团分子量 5’-Biotin 405.45 3’-TAMARA 623.60 5’-(6 FAM) 537.46 3’-Dabsyl 498.49 5’-HEX 744.13 3’-(6 FAM) 569.46 5’-TET 675.24 3’-Amino Modifier