多抗制备方案报告.docVIP

粟攒狐滁狈虱匙坤皿欺耳存帛典妆吻月依娩稼兔多抗制备方案报告 一、材料 　　(一)　动物：健康成年家兔，雄性，体重2～3公斤。 　　(二)　器材：剪刀、镊子、注射器(2ml、50ml)附针头(16号、12号、9号)、称量瓶(10ml)、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶(200ml)、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。 　　(三)　试剂 　　1.　灭菌生理盐水； 　　2.　抗原：合成多肽（5mg）冻干粉；纯化蛋白5mg/ml；（冻干粉可以先加入1ml灭菌生理盐水稀释成5mg/ml，使用时在取适量；也可以按实际情况使用，节约使用） 　　3.　75%酒精； 　　4.　 弗氏完全佐剂（FCA）sigma产品； 弗氏不完全佐剂(FIA) sigma产品； 二、免疫方法 抗原剂量为1mg/每只每次，具体方法如下： 1．用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分兔毛，以75%酒精消毒皮肤； 2．第一次免疫: 将1mg IgG抗原用生理盐水稀释至0.5ml，再加入等体积的弗氏完全佐剂(即FCA 0.5ml)，用2ml注射器充分混匀后于两只后足垫(即脚掌皮下)0.5ml； 3．第二次免疫：与第一次间隔10-14天，将1mg IgG抗原用生理盐水稀释至0.5ml，再加入等体积的弗氏不完全佐剂(即FIA 0.5ml)，用2ml注射器充分混匀后于背部皮下多点注射，每点注射0.1ml； 4．第三次免疫：与第二次间隔10-14天, 注射部位、剂量均同第二次； 5．与第三次免疫间隔5-7天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价(即试血)。效价至少应达到1∶16以上时才能放血。 6．若效价未达到要求，可用不加佐剂的抗原液(鼠IgG)耳静脉内注射免疫。即于1周内注射3次，分别为0.1、0.3、0.5ml。间隔1周再试血。如效价达到要求应立即放血。 三、放血 　　(一)　心脏采血法 　　1.　家兔仰面，四肢缚于动物固定架上(或由助手抓住四肢固定)； 　　2.　剪去左胸部兔毛，消毒皮肤； 3.　用左姆指摸到胸骨剑突处，食指及中指放在右胸处轻轻向左推心脏，并使心脏固定于左胸侧位置。然后，以左拇指触摸心脏搏动最强的部位（一般在第三和第四肋骨之间）； 　　4.　用50ml注射器(连接16号针头)，倾针45°角度，对准心搏最强处刺入心脏抽血； 　　5.　将抽取的血液立即注入无菌三角烧瓶中，待凝固后分离血清。 　　(二)　颈动脉放血法 　　1.　家兔仰卧同上固定。头部略放低以暴露颈部。剃毛及消毒皮肤； 　　2.　沿颈部中线切开皮肤约10cm，分离皮下组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌； 　　3.　分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后使之游离； 　　4.　于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用血管夹夹住； 　　5.　用尖头小剪刀在两根丝线间的动脉璧上剪一小口，插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱； 松开血管夹，使血液流入灭菌三角烧瓶中。一般一只家兔可放血80～100ml。 四、分离血清 将三角烧瓶的血置37℃温箱1小时，再置4℃冰箱内3～4小时。待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。于3000rpm离心15分钟，取上清加入防腐剂(0.01％硫柳汞或0.02％叠氮钠，最终浓度)，分装后置4℃冰箱中保存备用。 抗体的具体效价目前可以不用ELIAS做，直接用琼脂双向扩散实验在免疫三次后测下效价是否达到要求即可。 弗氏体即弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂，分为不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。不完全弗氏佐剂是液体石蜡与羊毛脂混合而成，组分比为1～5：1，可根据需要而定，通常为2：1。不完全佐剂中加卡介苗(最终浓度为2～20mg/ml)或死的结核分枝杆菌，即为完全弗氏佐剂（FCA）。 乳化方法：（1）研磨法：先将佐剂加热并取适量放入无菌的玻璃研钵内，待冷却后再缓缓滴入等体积的抗原溶液，边滴边按同一方向研磨，滴加抗原的速度要慢。待抗原全部加入后，继续研磨一段时间，使之成为乳白色 HYPERLINK /wiki/%E7%B2%98%E7%A8%A0 \o 粘稠 粘稠的油包水乳剂。本法适于制备大量的佐剂抗原，缺点是 HYPERLINK /wiki/%E7%A0%94%E9%92%B5 \o 研钵 研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大。（2）注射器混合法：将等量的弗氏佐剂和抗原溶液分别吸入两个注射器内，两注射器之间以一细胶管相连，注意排净空气，然后交替推动针管，直至形成粘稠的乳剂为止。本法优点是容易做到无菌操作，抗原损失少，适用于制备少量的抗原乳剂。但同时难以乳化完全，个别抗原，用塑料 HYPERLINK /wiki/%E6%B3%A8%E5%B0%84%E