光诱导表达载体的构建及其在盐藻除草剂抗性转化中的应用-病理学和病理生理学专业论文.docxVIP

郊州大学医学院2003年博士论文 郊州大学医学院2003年博士论文 光诱导表达载体的构建及其在盐藻除草剂抗性转化中的应用 (Dunaliella salinal具有更强的胡萝卜素合成能力，胡萝卜素含量占其 干重可达10％【8l。Dunaliella bardawil中的cbr基因是-,ee与胡萝卜素 生物合成相关的基因，cbr的表达与高等植物的早期光诱导基因(early light—induced genes，elip)的表达密切相关[8】，CBR蛋白后被认为是一种 玉米黄质结合蛋白，后者与CBR蛋白结合后形成的复合物对盐藻的光 合作用系统起一种保护作用【91， CBR基因是一种诱导表达的基因，诱 导条件包括强光、硫酸盐剥夺以及norflurazon(一种除草剂)处理等【9。。 业已证明，野生盐藻对许多抗生素具有抗性【10,11】：虽然盐藻对氯 霉素敏感，但根据我们实验室过去研究经验，用氯霉素抗性来筛选转 化的盐藻，现象不明显，筛选周期长；而后来我们自己的研究表明， 野生的盐藻， 无论是Dunaliella salinail2】还是Dunaliella bardawil(数 据未显)，均对除草剂草丁膦(phosphinothricin，PPT)敏感。最低3．0mg／L 剂量的草丁膦就能够完全抑制盐藻的生长。草丁膦系谷氨酸的结构类 似物，进入细胞后可以抑制谷氨酰胺合成酶从而导致细胞内积累高浓 度的氨而使细胞发生氨中毒【13】。Bar基因是除草剂抗性基因，其编码产 物草丁膦乙酰转移酶可以使PPT乙酰化而失去毒性【14,15】。 本实验室实践证明，对盐藻使用除草剂草丁膦筛选体系，效果明 显。 为对盐藻进行转基因研究，我们设计并克隆了一种光诱导的盐藻 表达载体，用于盐藻的瞬时转化和稳定转化。在该载体中我们将外源的 bar基因插入到Dunaliella bardawil的CBR基因的启动子(强光诱导表 达)之下，并在bar基因下游接上CBR基因的终止子(3-UTR， 3-untranslated region)，构成一个bar基因的表达盒。 作者在盐藻的培养等生物学特性的研究基础上，建立了两种盐藻转 七方法，即电激转染和磷酸钙共沉淀转染。利用自己构建的盐藻光诱导 茂体，分别通过电奴转染和磷酸钙共沉淀转染，进行盐藻的除草剂抗性 郑州大学医学院2003年博士论文 郑州大学医学院2003年博士论文 光诱导表达载体的构建及其在盐藻除草剂抗性转化中自皇生塑 转化，从细胞生物学和分子生物学的角度对两种转化方法进行了比较和 分析，为转基因盐藻生物反应器研究初步建立了两种比较稳定的转化方 法。 本研究论文分两部分，第一部分阐述盐藻光诱导表达载体pPB3R2a 的分子克隆过程；第二部分阐述对盐藻基本生物学特性的研究和用载体 pPB3R2a转化野生盐藻Dunaliella bardawil赋予其除草剂抗性以及对 DunalieUa．Bardawil转基因方面的研究工作，包括转基因的检测等。 1．方法 1．1盐藻光诱导表达载体pPB3R2a的构建 1．1．1盐藻Dunaliella bardawil的cbr基因启动子区片段的PCR扩增 首先提I汉盐藻Dunaliella bardawil的基因组DNA，根据cbr基因序 列，通过计算机引物设计程序PrimerPremier，设计巢式PCR两对引物， 外侧上游引物ebr5ws：5 7 GGCGGCGGAGAAAGGGAGAAGAAGAG3 7，外 侧下游引物：cbr5wx，5’AGAGGTGCGGGACGAACATTGATGGA3’； 一 划呐侧上游引物的5’端具限制序列及保护序列，上游引物为cbr5ns， 5 CGGGTCTAG_．△_ACCCCATTCGTCCTGTTTCTGGCTCT3’(Xba I)，下游引物 7 为cbr5nx，5 ATA—GAA—TYCGfTCATGTGCAGCTGCATCGTAGTIGG3’(EcoR I)。PCR 7 扩增反应分两步进行，第一轮反应应用上述1对外侧引物和自己研究的 一种改良的降落PCR程序，以提取的Dunaliella bardawil基因组DNA 为模板，进行扩增反应。巢式PCR第二轮反应以第一轮反应的产物为 模板，使用上述一对内侧引物，通过普通PCR程序进行扩增。最后将 第二轮反应的产物通过T．A克隆连接到T．载体上。 1．1．2 Dunaliella bardawil cbr基因3-UTR的PCR扩增 针对cbr基因3-UTR序列，设计一对5’端含限制序列的引物，上 镀存弓I彤丑cbr3up：5，GGG邕些叁鱼匿卫!mAGAGcAGAAIcTGⅡ(i(x：IG—口【℃AAcAA3‘(HindⅢ)， 郑州大学医