原理PKH26稳定的与细胞膜脂质区结合并发出红色荧光染色方式.DOCVIP

原理：PKH26稳定的与细胞膜脂质区结合并发出红色荧光，染色方式依赖于细胞与膜的类型，主要用于细胞体外标记、体外细胞增殖研究及体内外细胞示示踪研究。 成分：PKH26染料1瓶（0.1mL，1×10-3 M 贮藏：避光冷藏，用前检查结晶，如有结晶需在37℃水浴溶晶。因在乙醇中贮藏，所以要盖紧防挥发。 稀释液C：常温或冰箱保存，无防腐剂和抗生素，保持无菌。 染料的工作液随用随配，不要将配好的染料贮存。 步骤：所需材料：均匀的单细胞悬液；含血清培养基；无血清培养基或不含Ca2+Mg2+的PBS液；血清、白蛋白或与培养基兼容的蛋白源；聚丙烯锥形离心管；温度可控的离心机（0-1000g）；荧光分析仪（荧光计，荧光显微镜，流式细胞仪，荧光图象分析仪）；超净台；细胞计数仪；载玻片。 无菌操作示范步骤（总体积2ml，染色终浓度为2×10-6M PKH26染料和1×107 胰酶和/或EDTA消化细胞形成单细胞悬液； 所有操作在25℃进行，2×107细胞于锥形离心管中，用无血清培养基洗一次。 400g（500rpm,5min）离心5min形成松散的细胞团。 吸去上清，细胞团上剩余液体25μL。 加1mL稀释液C，重悬细胞保证完全离散，别震荡。 染色前，准备4×10-6M（稀释250倍，约1.5μL(2瓶细胞用量)?0.5~1mLC液）的PKH26染液（用稀释液C稀释）置于离心管中。为使乙醇影响最小，染料的加入量应小于总量的1%。如果需更大的稀释染料，应用无水乙醇25℃ 尽快加1mL细胞到0.5mL~1mL稀释后染料液中(等比最好)，立即用吸管均匀快速混合样品，因为均匀的染色是在瞬间发生的。 25℃孵育的2-5min，定时轻轻颠倒离心管保证在25℃充分混匀。 加入等量血清(或1%BSA)中止染色反应，孵育1min。 用等量含血清培养基稀释中止的反应液。不用稀释液C。 400g(800rpm,6min)25℃离心10min，去上清。 细胞团转入新试管中，进一步洗三次(1000rpm,2min)。 加10mL完全培养基，离心，重新悬置细胞到所需浓度。 荧光显微镜、流式细胞仪分析细胞。检查细胞复苏情况、传代情况及荧光浓度。染色应均匀，比本底荧光高100-1000倍。 注意事项： 标记时应无叠氮化物或膜毒性物质的存在。 为获得均匀染色，单细胞悬液是必须的。 染色前去除血清和脂质以提高染色效果。 盐的存在会导致染料形成颗粒，干扰染色反应。因此，加染料前细胞重新悬置是很重要的。染料应直接加到细胞悬液中，而不是加到细胞团上。 快速均匀的混合对标记也很重要，为获得最佳效果应采取下述措施： 混合时细胞悬液和工作染液应等量； 避免染太多(5mL)或太少（100μL）的液体。避免用沾血清的移液管加染料； 液体量应尽可能精确以保证细胞和染料浓度被精确复制。 染料和稀释液作用于细胞的时间尽量短，有一定毒性。为评价损害，可用稀释液按上述步骤作用于细胞看其受损程度。 加等量血清终止反应，在终止染色反应前别离心稀释液C中的细胞，清洗时用含血清培养基可增加清洗效果。 细胞应单独移至新试管中离心，清洗3次时不用稀释液C而用培养基。 可用于体外干细胞、淋巴细胞、单核细胞、内皮细胞等的标记较理想。 全细胞标记应先于单抗染色的标记，当4℃单抗染色时细胞跟踪探针将保持稳定；如后于单抗染色的标记，很可能出现“盖帽”现象。 染色细胞用2%多聚甲醛固定稳定性达3w以上。 血小板标记时方法要作修改。 过度的细胞标记将导致膜完整性丧失、细胞数量下降。 本样品细胞和染料浓度是参照浓度适合大部分细胞，但最佳染料/细胞由使用者根据细胞类型和实验目的决定，另外使用者还要评估细胞的生存力（排碘），荧光强度，荧光峰值的变异系数，染色的均匀性。