烟草细胞经典教程.pptVIP

* 烟草细胞中茉莉酸信号通路自动化和标准化的瞬时表达分析探究 汇报人：*** 三、研究需要 随着通过分析基因组规模数据集获得许 多新的候选基因，例如微阵列转录模式或蛋白质-蛋白质的互作研究，并且只有少量的能够用于转基因研究。因此就需要有新的方法来迅速测定基因的功能和鉴定新基因 。 瞬时表达分析不适合复杂的生物体研究，但是植物原生质体瞬时表达分析在研究广泛的分子机制，包括信号传导和新陈代谢通道，以及转录的网络调控是很有用的。 何为瞬时表达(Transient expression) 瞬时表达：外源基因进入受体细胞后，未整合进受体细胞基因组而立即转录，出现基因产物 。 是一种快速的研究基因表达、蛋白质亚细胞定位及基因间互作的一种重要手段，与传统的转基因相比，瞬时表达不需要整合到染色体上，因此具有简单、快速、周期短、准确等优点 。瞬时表达不受基因的位置效应和基因沉默的影响，表达效率较稳定，转化率高。同时，瞬时表达不产生可遗传的子代，生物安全性高。 本文要点 实验用的载体选择方法 原生质体PEG自动化转染 双荧光素酶转录读出标准化分析 原生质体转化效率分析 尼古丁生物合成途径中潜在调控因子筛选 NtORC1 和NtJAP1 转入BY-2 影响分析 设计自动化瞬时表达系统 根据已发表的瞬时表达步骤(/sheenweb)，设计了自动化的瞬时表达操作系统。该系统在TECAN Genesis 200机械化平台上进行 操作。（为本文章所独创的）。该系统的好处如下： 1、降低了实验规模和容器的需求量。 2、与传统的原生质体富集相比，该系统采用简单的微滴定沉淀法。 3、自动化移液，精确简单。 4、周期短，小于2天，严格的无菌环境。 自动化操作系统 载体质粒对比分析 在任何实验方案中，能够准确又简单的克隆出所有必需的DNA片段是很重要的，目的是为了对大型基因组进行系统的功能分析 本文设计将绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶 ，分别连接大的双向T-DNA质粒和最小的骨架质粒，转入拟南芥和烟草BY-2原生质体进行瞬时表达。结果表明最小质粒的表达效率高。确定实验用的载体质粒为大肠杆菌最小质粒 比对结果 双荧光素酶转录读出分析标准化 瞬时表达分析最终结果受到很多内在因素的影响，比如原生质体的异质性，移液误差和DNA的含量等。为了对瞬时表达分析进行标准化，参考了生物统计原理，本文通过萤火虫荧光素酶（fLUC）和海肾荧光素酶（rLUC），分别连接上35S CaMV promoter，形成35Spro::fLUC::35Ster 和35Spro::rLUC::35Ster，做共瞬时瞬时表达分析，共测定了八组48个样品在42分钟内的酶活性变化。 酶活测定结果 分析 上图显示，尽管fLUC和rLUC的酶活数目不同，但是有相同的趋势，他们的关联系数R =0.932。HEAT map 显示相同的样品之间fLUC酶活性就存在很大的差异。他们之间的平均标准误为6.9%，但是根据统计学关联差异度，如果以rLUC的酶活数目为内部调控做标准化，这种标准误就降低到了2.6%。 这就说明，在瞬时表达分析时，加入内部调控报告基因，能够大大降低误差。 转化效率研究 分别以拟南芥PSB-L细胞原生质体和烟草BY-2细胞原生质体为转录体，用10 μg带有35Spro::eGFP::35Ster最小载体DNA做瞬时表达分析，20h后，荧光蛋白量达到30%。如果想提高含量，需要长时间的孵育。fLUC需要超过一天。 质粒DNA的用量标准验证 因为质粒DNA的总量是瞬时表达实验的一个限制因子。设计了带有35Spro::rLUC::35Ster的最小质粒，转染拟南芥和烟草BY-2.来测定0.5–10 μg之间，rLUC的活性。BY-2显示的是一个对数关系曲线(R2=0.9943; n=8)，拟南芥显示的是一个指数关系(R2 =0.9941; n =4)。根据瞬时表达的要求原生质体数目为104 到105 原生质体数，选择了BY-2的使用量为1μg。 图示（R平方为相似度） 烟草茉莉酸信号途径研究 技术路线 一、茉莉酸处理结果分析 二、 发生改变的基因分类 三、确定基因研究参考指标 四、实验验证参考指标 五、筛选可能的诱导基因 六、过表达研究获得的基因 何为BY-2细胞 烟草BY2细胞(Nicotiana tabacum L．ev Bright Yellow 2。BY2)是一个非常重要且用途广泛的细胞系。它由Kato 等于1972分离得到．在现有已建立的成熟植物细胞系 中被认为是植物细胞中的Hela细胞。BY2细胞可以比较 容易的转化外源基因，且转基因细胞团和悬浮培养细 胞都较易得到。此外，该细胞系具有高度的同一性，并且