海马齿胚胎发育晚期丰富蛋白基因Splea5的克隆与功能分析-植物学专业论文.docxVIP

㈣Y ㈣Y 引¨●I● ㈣9 删3Ⅲ3 ⅢⅢⅢ●I ㈣3 ㈣8 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明： 所．凡．交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究．：『：作所取 得的成果。除文中已经注明引刚的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写 过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名：／f寺 日期：为f／年∥月f-日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即；学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。可以采川影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。本人在导师指导’卜． 南人学和中国热带农业科学院。 保密论文在解密后遵守此规定 诂文作者签名：彳专术乞 日期：枷l『年6 月f日 本人已经认真阅读“CALLS高校学位论文全文数据库 文提交“CALLS高校学位论文全文数据库”中全文发布。 权益。同意论文提交后滞后：口’卜年；II一年；口_二年发 论文作者签名：／1古桂 日期：∞f『年‘ 月岁 日 摘 摘 要 海马齿(Sesuvium pOrtu]acastrum)属于番杏科海马齿属，是一种生长在 海边沙地及河流入海口两岸滩涂地带的多年生匍匐性红树林伴生肉质草本植物。 由于生活环境的特殊性，海马齿可以常年在海水浇灌下正常生长，并完成其生活 史，属于典型的盐生植物。同时，海马齿对于其他的逆境比如：干旱，低温和重 金属等也具有很高的耐受性。 为揭示海马齿耐盐的生理和分子基础及其机制，本实验室采用抑制差减杂交 技术(Suppression Subtractive Hybridization，SSH)，成功构建了海水诱导 下海马齿根系差异表达基因cDNA文库，获得了一批差异表达的EST序列。在对 部分差减EST序列分析时发现，SpSSH 860编码的氨基酸序列与其他植物来源 的胚胎发育晚期丰富蛋白Lea5具有较高的同源性。为深入研究与EST SpSSH 860 对应基因的结构和功能，本研究克隆了相应基因全长的cDNA，分析了其结构特 征、表达谱并对其功能进行了探讨。 主要研究结果如下： 1．采用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术，从海马齿中成功 克隆了胚胎发育晚期丰富蛋白基因，命名为命名为SpLeaSo(GenBank登录号： HQ427488)。经序列测定和分析表明，该基因cDNA全长685bp，含有146bp的5 ，端非编码区、245bp的3’端非编码区和一个294bp的开放阅读框，编码97个 氨基酸残基。其基因组序列还有一个内含子和两个外显子。 2．生物信息学分析表明，SpLea5基因拥有Lea5家族共有的保守残基W(A／V) PDP(V／I)TGYYRPE。利用系统进化分析，推测编码的氨基酸序列与柽柳(Tamarix androssowii，ABG5448 1)、烟草(Nico tiana tabacum，从C06242)、温州蜜柑 (历trusunshiu，ABD93882)、大豆(Glycine胧Ⅸ，从B38782)和陆地棉(Gossypium hirsutum,P46522)中相应的Lea5序列的一致性分别达到54％、52％、47％、44％ 和41％。分子进化树分析，表明该基因与柽柳的进化关系最近。 3．利用半定量RT-PCR技术分析了SpLea5的表达特征。结果显示，SpLea5 的表达具有明显的组织差异性，海马齿根中的表达量最强，茎次之，最少的是叶 片。海水、NaCl、ABA和干旱(PEG)等非生物胁迫均能诱导SpLea5基因的表达， 推测该基因可能参与了海马齿对非生物胁迫的分子响应。 4．为更深入确切了解该基因在非生物胁迫的分子响应中的作用，成功构建 原核表达载体pET-30a-SpLea5,获得了特异表达蛋白，为对其以后的蛋白质的 理化性质研究打下了基础；同时，成功构建了植物表达载体pCAMBIAl304- SpLea5,通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法获得了41株转基因烟草植株。抗逆 性实验结果表明，转基因烟草对干旱和高盐都有很好的抗性。 结论：SpLea5在海马齿中具有明显的组织差异性，海马齿根中的表达量最 强，茎次之，最少的是叶片。海水、NaCI、ABA和干旱(PEG)均能诱导SpLea5 基因的表达。可推导SpLea5基因在海马齿能够长期生活在海水中，并能完成生 活史中发挥了一定的作用。通过在烟草中