课件：第十六章细菌基因工程.pptVIP

第二节 细菌基因工程的表达系统 表达系统组成：外源基因、表达载体和宿主细菌。 1）表达载体(expression vector) 用来控制转录、翻译、蛋白质稳定性以及克隆基因产物的分泌等遗传元件。 2）宿主细胞： 大肠杆菌、枯草芽胞杆菌 酵母及动物、植物、昆虫细胞、动植物个体等 2019 - * 一 表达载体构建原则 表达元件的选择和利用 克隆载体：满足在宿主菌中复制和选择要求的载体。 质粒载体，整合载体。 大肠杆菌外的细菌中应用的克隆载体一般是穿梭载体，含有大肠杆菌克隆载体的序列，便于在大肠杆菌中扩增和制备。 例如，用于苏云金芽胞杆菌的克隆载体pHT304的基础骨架为大肠杆菌克隆载体pUC18, 另装有能在Bt中复制的质粒复制区序列ori1030和用于选择的红霉素抗性基因。 2019 - * 1. 启动子的选择 1）选择强启动子超量表达外源基因，最大限度地获得蛋白质产物。 如E. coli 中的lac、tac和T7等可调控强启动子 2）采用基因自身的启动子或宿主菌的相关性状基因的启动子表达关键基因，使宿主菌表现出一种特殊的性状，或启动其他产物的大量合成。 不一定要高量表达，只需正常表达。 2019 - * 2. 转录的有效性 在表达载体上设法除去衰减序列或插入抗转录终止序列以避免转录的提前终止，促使mRNA有效地延伸和终止。 在终止密码子后增加终止子序列，使转录有效终止，并延长mRNA的半衰期。 2019 - * 3. 翻译起始的有效性 翻译起始是多种成分包括mRNA、16SrRNA、fMet-tRNA，核糖体S1蛋白、蛋白合成起始因子之间的协同作用的过程。 要使翻译起始效率最高，要满足以下条件： ①选用最佳起始密码子AUG（偶尔为GUG和UUG）； ②S-D序列（Shine-Dalgarno sequence）接近或与以下序列完全相同：5′…AGGAGG…3′； ③除S-D序列外，处于起始密码前的两个核苷酸应该是A和U； ④如果在起始密码AUG后的序列是GCAU或AAAA序列，能使翻译效率提高； ⑤在翻译起始区不能形成明显的二级结构。 2019 - * 4.翻译的有效终止 采用UAA或一连串的终止密码来有效终止原核细胞翻译。 2019 - * 二 外源基因表达的方式 1．外源基因以融合蛋白形式表达 目标基因与编码具有特殊活性的多肽或蛋白质的基因融合，构建成一个融合蛋白基因。 用于融合的表达标签(tag)蛋白和多肽： 六聚组氨酸肽(6xHis)和谷胱甘肽S-转移酶(GST) 利用tag的特性可以对融合蛋白进行亲和层析等分离提纯，因此融合表达既可以保护外源蛋白不受宿主内蛋白酶的降解，同时也大大简化了重组蛋白的纯化过程。 2019 - * 2．构建可分泌蛋白，分泌到胞外培养基中 位于蛋白质N端称为信号肽的一段氨基酸序列会帮助蛋白通过细胞膜。通过基因操作可在外源蛋白的N端添加编码信号肽的DNA序列，形成一个分泌蛋白。 缺陷： 仅仅是信号肽序列的存在并不能确保高效分泌，并且革兰氏阴性细菌由于外膜的存在，也不能使分泌蛋白进入周围的培养基。 解决方法： 1）使用革兰氏阳性细菌或真核生物细胞，它们都缺少外膜，能直接分泌蛋白进入培养基。 2）通过遗传工程将革兰氏阴性细菌改造成蛋白质分泌型。 2019 - * 3. 外源蛋白在宿主细胞中以包涵体的形式表达 包涵体是致密的不溶性复合物，含有大部分的表达蛋白，可以抵抗宿主细胞中蛋白水解酶的降解，也便于纯化。 一些以可溶性蛋白形式表达时易被降解的蛋白质，以包涵体形式表达时却可以很稳定。通过超声波破碎、离心等能较容易地对之进行初级纯化。用盐酸胍或尿素变性溶解包涵体中的蛋白质，透析除去变性剂后，蛋白质可重新折叠复性。 缺陷：经变性/复性后正确折叠的蛋白质的产量不稳定，有时会很低，更有些蛋白尤其是分子量较大的蛋白基本上不能正确进行重折叠 2019 - * 4. 外源基因在细胞表面的表达（表面展示技术cell surface display ） 把目的蛋白基因序列(外源蛋白)与特定的载体蛋白基因序列(又叫定位序列)融合后导入微生物宿主细胞，从而使目的蛋白表达并定位于微生物细胞表面。 2019 - * 三、常见细菌表达系统 大肠杆菌并不一定是所有外源蛋白表达的理想微生物，除了大肠杆菌以外，还有许多其他细菌的表达系统 1、革兰氏阴性细菌通用的表达载体 2、枯草芽胞杆菌表达系统 2019 - * 1、革兰氏阴性细菌通用的表达载体 pAV10 在低拷贝数、广宿主质粒pRK290的多克隆位点中插入来源于转座子T