海参cDNA文库的构建和序列分析以及组织蛋白酶L基因的克隆-发酵工程专业论文.docxVIP

缩略词表缩略词表 缩略词表 缩略词表 Amp ampicilin 氨苄青霉素 BLAST basic local alignment search tool 基本局域联配搜索工具 cDNA complementary DNA 互补DNA bp base pair 碱基对 DEPC diethylpyrocarbonate 焦碳酸二乙酯 DNA deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核苷酸 EB ethidium bromide 溴化乙锭 IPTG isopropylthio—p-D—galactoside 异丙基硫代．D．D．半乳糖苷 kb kilobasc 千碱基对 NCBI National Center for Biotechnology Information 美国国立生物技术信息中心 Ol强 open reading frame 开放阅读框架 J PCR chain reaction 聚合链式反应 polymerase RACE rapid amplification eDNA end eDNA末端快速扩增 ● IU’-PCR reverse transcription-polymerase chain reaction 逆转录聚合链式反应 RNA ribonucleic acid 核糖核苷酸 X—gal 5-bromo-4一chloro-3-indolyl-D—D·galactoside 5．溴4．氯．3．吲哚．p．D．半乳糖苷 UTR untranslated region 不翻译区 CL cathepsin L 组织蛋白酶L CLAP cathepsin L-associated protein 组织蛋白酶L相关蛋白 EST expressed sequenee tags 序列表达标签 ．． 摘 摘 要 摘 要 应用Gubler-Hoffman eDNA Library Construction技术，构建仿刺参eDNA文库。 测试结果表明，库容量为2．O×106 pfu／ml，利用PCR方法检测eDNA文库插入DNA 片段的大小，其长度范围在O．5-4．1 kb，插入片段平均长度为1．3 kb，表明该文库达到 建库要求，可用来筛选低丰度mRNA的基因克隆。随机挑选100个l kb以上的eDNA 克隆进行测序分析，发现有26条EST序列和网上公布其它物种的序列相似性较高，这 些基因与刺参能量代谢和蛋白水解相关。其中发现的几个重要基因，如编码遍在蛋白 以及缬酪肽蛋白和组织酶L相关蛋白等，可能与仿刺参自溶过程的蛋白酶水解和细胞 凋亡事件相关。另有74条EST序列相似性较低，推测可能是功能未知的新基因。组织 蛋白酶L是一种嗜酸性溶酶体蛋白水解酶，广泛存在于人体各种正常组织细胞和肿瘤 细胞中，它不仅参与生物体内各种蛋白水解，还参与许多重要的生命活动，如抗原呈 递、肿瘤入侵和转移、骨质吸收、细胞凋亡等。研究表明，组织蛋白酶L和组织蛋白 酶L相关蛋白是同一蛋白的不同亚基，组织蛋白酶L相关蛋白和组织蛋白酶L以对接 形式存在，组织蛋白酶L相关蛋白对组织蛋白酶L的靶向作用和表达及其活性起着重 要的作用。通过对刺参eDNA文库的部分筛选和序列分析，我们发现了一条组织蛋白 酶L相关蛋白基因(GenBank：EU306878)。全长eDNA为1335 bp．5’非编码区(UTR)91 bp，3UTR 489b，开放阅读框长度756 bp，编码251个氨基酸。为此我们提取刺参总 RNA，通过RT．PCR和RACE PCR技术，从刺参(Stichopus／aponicus)体壁中克隆得到 全长的组织蛋白酶L基因(GenBank：EUl43709)。其中全长eDNA l 129 bp，5’非编码 区(UTR)202 bp，3’UTR 87 bp，开放阅读框999 bp，编码332个氨基酸(砚)，包 括成熟肽316 aa和信号肽16 aa。 关键词：eDNA文库，刺参，组织蛋白酶L相关蛋白，组织蛋白酶L，RT—PCR，测序分 析 AbstractAbstract Abstract Abstract eDNA library was constructed、析tll Gubler-Hoffman according to Takara eDNA Library Construction Kit．The titer of the constructed library is 2．0 106 pfu／m1．The PCR results by randomly isolated 30 clones showed that all of them contain recombinant DNA fragments and th