常规PCR法扩增口蹄疫病毒基因组5 端序列的探索.pdfVIP

新疆农业科学 ２０１８,５５(３):５７２-５８０ Ｘｉnｊｉａng Ａgｒｉcuｌｔuｒａｌ Scｉences doｉ:１０．6０４８/ ｊ．ｉssn．１００１-４３３０．２０１８．０３．０２１ 常规 PCR法扩增口蹄疫病毒 基因组５’端序列的探索 １ ２ ２ １ ２ 朱 研 ,苗书魁 ,马文戈 ,李金娜 ,魏玉荣 , ２ ２ ２ ２ 汪 萍 ,魏 婕 ,米晓云 ,黄 炯 (１新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐 ８３００５２; ２．新疆畜牧科学院兽医研究所/ 新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心,乌鲁木齐 ８３００１１) 摘 要:【目的】扩增口蹄疫病毒（ｆooｔ-ａnd-mouｔｈ dｉseａse vｉｒus，FＭDＶ)基因组５’端序列，为获得基因组全长 准备基础。 【方法】将FＭDＶ O/ Ａkesu/ ５８ CＥ３９Ａ株液氮冻存基因组RＮＡ反转录三次，对cDＮＡ 的５’端序列 进行扩增、克隆、测序。 【结果】以cDＮＡ１与cDＮＡ３为模板，用ＬＡ Taq DＮＡ ｐoｌymeｒａse、ＥＸ Taq DＮＡ ｐoｌymeｒ- ® ａse、PｒｉmeSTＡR ＨSDＮＡｐoｌymeｒａse及３对引物 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均未扩增出５’端目的片段;以cDＮＡ２为模板，用ＬＡ Taq DＮＡｐoｌymeｒａse为扩增酶，两对引物 Ⅰ、Ⅱ均能扩增出５’端目的片段，且所测得的序列长度７８７ bｐ、７９７ bｐ 与参考序列核苷酸同源性分别为８6．２%和８6．３%。 【结论】常规PCR法扩增５’端序列较其它技术具有价格 便宜、操作简便等优点，但扩增成功率偏低。 试验共进行了７２次PCR，成功率为6/ ７２，说明FＭDＶ ５’端序列 的扩增难度大，应合理设计反转录引物和扩增引物。 为许多RＮＡ病毒反向遗传学研究提供了更多的选择。 关键词:口蹄疫病毒;常规PCR;５’端序列;基因扩增 中图分类号:S８５５ 文献标识码:Ａ 文章编号:１００１-４３３０(２０１８)０３-０５７２-０９ 囊膜单股线状正链RＮＡ组成，包括约１３００ nｔ 的 ０ 引言 ５’非编码区（５’unｔｒａnsｌａｔedｒegｉon，５’UTR) 、约 【研究意义】口蹄疫（ｆooｔ -ａnd -mouｔｈ dｉs- 6．５ kb 的 １ 个大的开放阅读框（oｐen ｒeａdｉng eａse，FＭD)被世界动物卫生组织（Oｆｆｉce Ｉnｔeｒnａ- ｆｒａme，ORF) 、约９０ nｔ 的３’非编码区（３’unｔｒａns- [３] ｔｉonａｌ Des Ｅｐｉzooｔｉes，OＩＥ)列为法定上报的动物疫 ｌａｔedｒegｉon，３’UTR)及 ｐoｌy（Ａ)组成 。 在口蹄 [１] 病，被我国农业部列为一类疫病 。 口蹄疫病毒 疫RＮＡ 基因组 ５’末端有一个特殊的小蛋白 [４] （ｆooｔ -ａnd -mouｔｈ dｉseａse vｉｒus，FＭDＶ)分为O、 （ＶPg)，通过磷酸二酯键与尿嘧啶残基相连 。 Ａ、C、SＡT１、SＡT２、SＡT３、Ａsｉａ