《临床免疫学与检验》课件：第八章 荧光免疫技术.pptVIP

第八章 荧光免疫技术;第二节 荧光抗体技术 　一、标本的制作 　二、荧光抗体的制备 　三、荧光抗体染色与结果判断 　四、荧光显微镜的基本结构 第三节 荧光免疫分析的类型 　一、时间分辨荧光免疫测定 　二、荧光偏振免疫测定 　三、荧光酶免疫测定;第四节 荧光免疫技术在医学检验中的应用 　一、荧光抗体技术的应用 　二、荧光免疫测定的应用 思考题 小结;第一节 概 述;荧光（fluorescence）;发射光谱和激发光谱 ;荧光效率;荧光寿命;荧光淬灭 ;荧光偏振 ;荧光物质;第二节 荧光抗体技术;荧光抗体技术的基本原理;荧光抗体技术的内容;抗体要求;有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。 荧光效率高，与蛋白质结合后，仍保持较高的荧光效率。 荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。 与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。 标记方法简单、安全无毒。 与蛋白质的结合物稳定，易于保存。;抗体的荧光素标记;去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤 去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法 去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收;荧光素与蛋白结合率： F/P= 抗体效价：双向免疫扩散试验 抗体特异性：吸收试验、抑制试验 抗体抗体特异性染色滴度：倍比稀释;-20℃：保存1～2年 真空干燥：长期保存;组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用） 印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织 涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液 培养细胞：单层培养细胞;冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清晰。 石蜡切片：组织细胞结构显现清楚，抗原损失多。;固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等 保 存：4℃、-20℃;直接法;;双标记法; 设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型; “-”：无或仅见极微弱荧光。 “+”：荧光较弱但清楚可见。 “++”：荧光明亮。 “+++”：耀眼强荧光。 特异荧光强度“++”以上判定为阳性，对照光应呈“-”或“±”。 根据呈++的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。 ;荧光显微镜;光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯 滤光片：隔热、激发和吸收滤光片 光路：透射光、落射光 聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器 镜头：消色差镜头 ;隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。 激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长 的光域，提供合适的激发光。 吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过，保护眼睛。;透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。 落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。;第三节 荧光免疫分析的类型;荧光免疫分析的基本原理;荧光抗体技术;荧光免疫测定的方法类型;自发荧光寿命短:1ns～10ns 镧系元素寿命长:10μs～1000μs 短寿命荧光完全衰变后再测定镧系 元素特异荧光 ;stokes位移:激发光谱和发射光谱的波长差 镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱 和发射光谱不重叠;发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少 激发光谱带较宽：300nm～350nm，灵敏度高;比活性：单位时间每个标记分子被探测的信号量 荧光激发光源1000次/S激发，比活性提高;结合β-二酮体; 镧系元素 铕(Eu3+)（最常用） 钐(Sm3+) 铽(Tb3+) 钕(Nd3+) 镝(Dy3+);标记方法;方法类型;方法类型;方法类型;方法类型;灵敏度高：最小检出量10-18mol/L 分析范围宽：4～5个数量级 标记物稳定：有效使用期长 测量快速，易自动化 易受污染，本底增高;光线通过偏振滤光片后， 形成一个方向的平面光称 为偏振光。; 抗原抗体竞争反应 AgF分子小，转动速度快，偏振荧光弱 AgF-Ab分子大，转动速度慢，偏振荧光强 若待检抗原多，则AgF-Ab少，AgF多，偏振荧光弱 待检抗原含量与偏振荧光强度成反比;方法评价 ;基本原理;酶和荧光底物;方法类型;方法类型;方法类型;方法类型;方法评价 ;第四节 荧光免疫技术在医学检验中的应用;①自身抗体检测;②病原体检测;③免疫病理检测;④细胞表面抗原和受体检测;时间分辨荧光免疫测定： 蛋白质、激素、药物、肿瘤标记物、病原体抗原/抗体等 荧光偏振免疫测定： 药物、维生素、激素、常规生化项目等 荧光酶免疫测定： 病毒抗体、细菌和毒素抗原、激素、肿瘤标志物等;1．荧光、荧光效率、荧光寿命和荧光淬灭的概念是什么？ 2．常用的