课件：第二章发酵工业微生物菌种.ppt

影响原生质体制备因素 在菌体生长的培养基中添加甘氨酸，可以使菌体较容易被酶解。甘氨酸的作用机理并不十分清楚，有人认为甘氨酸渗入细胞壁肽聚糖中代替D-丙氨酸的位置，影响细胞壁中各组分间的交联度。 不同菌种对甘氨酸的最适需求量各不相同。在菌体生长阶段添加蔗糖也能提高细胞壁对溶菌酶的敏感性。蔗糖的作用可能是扰乱了菌体的代谢，最适的蔗糖添加浓度随不同菌种而变化。 甘氨酸 青霉素 青霉素能干扰肽聚糖合成中的转肽作用，使多糖部分不能交联，从而影响肽聚糖的网状结构的形成，所以，在菌体生长对数期加入适量青霉素，就能使细胞对溶菌酶更敏感。 菌龄 菌龄也是影响溶壁的因素之一。一般处于对数生长中期细胞的细胞壁中肽聚糖含量很低，对溶菌酶敏感。 渗透压 原生质体对渗透压极其敏感，低渗将引起细胞破裂。一般是将原生质体放在高渗的环境中以维持它的稳定性。 对于不同微生物，原生质体的高渗稳定液组成也是不同的。如细菌的稳定液常用SMM液(用于芽孢杆菌原生质体制备和融合，其主要成分是蔗糖0.5M, 顺丁烯二酸0.02M, MgCl20.02M)和DF液(用于棒状杆菌原生质体制备和融合，主要成分是蔗糖0.25M, 琥珀酸0.25M, EDTA0.001M, K2HPO40.02M, KH2PO40.11M , MgCl2 0.01M)。在链霉菌中用得较多的是P液(主要成分蔗糖0.3M, MgCl20.01M, CaCl20.25M及少量磷酸盐和无机离子)。真菌中广为使用的是0.7M NaCl或0.6M MgSO4溶液，高渗稳定液使原生质体内空泡增大，浮力增加，易与菌丝碎片分开。 * 2019 - 原生质体融合与再生 原生质体再生就是使原生质体重新长出细胞壁 ，恢复完整的细胞形态结构。不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，甚至一些非常接近的种，最适再生条件也往往有所差别，如再生培养基成分及培养温度等。但最重要的一个共同点是都需要高渗透压。 原生质体融合通过化学因子或电场诱导的方法。 能再生细胞壁的原生质体只占总量的一部分。细菌一般再生率为3-10%。但有资料报道，在再生培养基中添加牛血清白蛋白，可使枯草杆菌原生质体的再生率达100%。真菌再生率一般在20-80%。链霉菌再生率最高可达50%。 为获得较高的再生率，在实验过程中应避免因强力使原生质体破裂。 涂布时，原生质体悬液的浓度不宜过高。因为若有残存的菌体存在，它们将会率先在再生培养基中长成菌落，并抑制周围原生质体的再生。 另外，菌龄、再生时的温度、溶菌酶用量和溶壁时间等因素都会影响原生质体的再生。 * 2019 - 筛选优良性状融合重组子 原生质体融合后，来自两亲代的遗传物质经过交换并发生重组而形成的子代称为融合重组子。这种重组子通过两亲株遗传标记的互补而得以识别。如两亲株的遗传标记分别为营养缺陷型A+B-和A-B+，融合重组子应是A+B+或A-B-。 重组子的检出方法有两种：直接法和间接法。 直接法将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子的高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子； 间接法把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株和重组子都再生成菌落 ，然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出重组子。 * 2019 - 5. DNA重组技术 DNA重组技术：按照人的意志，将某一（供体）的遗传信息在体外经人工与载体相接（重组），构成重组DNA分子，然后转入另一生物体（受体）细胞中，使被引入的外源DNA片段在后者内部得以表达和遗传。 开辟了一个分子育种的新领域---分子育种 * 2019 - 分子育种：利用基因工程技术、原理和设备，在分子水平上改良菌种。 优越性： 1.增加生物合成基因量而增加抗生素的产量； 2. 导入强启动子或抗性基因增加抗生素产量；] 3.两种不同基因在体外重组后再导入受体内可以合成杂交抗生素； 4.激活沉默基因 5.把异源基因克隆到宿主中表达，以期彻底改变生产工艺。 * 2019 - DNA重组技术的基本过程 1.目的基因的取得 有三种途径： 从供体中直接提取 通过反转录取得cDNA 化学合成特定功能的目的基因 * 2019 - 2.优良载体的选择 具有一个自我复制能力的复制子 能在受体细胞内大量繁殖； 最好只有一个限制性内切核酸酶的切口； 必须有一种选择性遗传标记 * 2019 - 3.目的基因与载体DNA的体外重组 采用限制性酶切或人为地在DNA的3?端接上polyA和polyT可以使重组的两个DNA分子产生“卯眼”似的粘性末端。然后两者在5~6℃下“退火”形成新的双链，在连接酶的作用下形成重组载体 * 2019 - 4.重组体导入受体细胞 5.重组受体细胞的筛选和鉴定 筛选类别 遗传学直接筛选法：抗药性、噬菌斑形成能力等 分子生物学间接法：酶切相对分子量的大小、分子杂交