第九章 细菌感染分子生物学检验.pptVIP

;细菌感染是致病菌或条件致病菌入侵机体，并在机体中生长繁殖，产生毒素或其他代谢产物所引起的全身性感染，临床上以寒战、高热、关节疼痛等为特征，部分患者还可以出现烦躁、四肢厥冷、发绀、呼吸加速、血压下降、感染性休克等临床症状。 传统上对于细菌感染的病原体检测主要采用免疫学、微生物学和血液学等相关技术，但这些技术方法受灵敏度和特异性的限制，不易达到早期诊断。 利用分子生物学技术检验感染性病原体自身遗传物质（RNA或DNA），从而达到早期、快速、敏感、特异地检测已经成为临床检验的主流技术之一。;第一节 细菌感染的分子生物学检验策略;分子生物学检验是以核酸（DNA或RNA）或蛋白质分子为检验目标，通过检查人体内源基因或外源（病原体）基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态或疾病作出特异性诊断的方法和过程。 机体感染细菌后，应用分子生物学技术直接测定这些细菌病原体基因，不仅可以对微生物感染作出明确诊断，同时也能诊断出带菌者或潜在性感染，还可以对感染性病原体进行分型和耐药性监测。; 一、细菌感染的一般性检出策略 细菌感染性的分子生物学检验的一般性检出就是以感染病原体的特异核酸序列作为检测目标序列，利用分子生物学技术对目标序列进行检测，从而直接判断有无细菌感染和是何种病原体感染。 二、细菌感染的完整性检出策略 完整性检出策略，即不仅对病原体作出快速准确诊断，还需要对其进行分型（包括亚型）和耐药性等方面的检测，尽可能地为临床诊疗提供更为详尽的细菌病原体的相关信息。;第二节 结核分枝杆菌的分子生物学检验;结核分枝杆菌(TB)，简称结核杆菌，是引起结核病的病原体。随着抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度大幅下降。近年，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困及人口广泛流动等因素，全球范围内结核病的疫情死灰复燃。 据WHO统计，全世界约1/3的人感染了结核分枝杆菌，在某些发展中国家成年人中群中结核分枝杆菌携带率高达80%，其中的5%~10%携带者可发展为活动性结核病。;TB是一种革兰氏阳性菌，G+C含量高，其细胞壁除肽聚糖层外，还含有另外一层由特殊脂质、糖脂和多糖组成的附加层。TB呈细长略弯曲，常聚集成团，用抗酸性染色被染成红色。;TB的培养特点：馋、懒、丑。 馋--营养要求较高，必须在含血清、卵黄、马铃薯、甘油以及含某些无机盐类的特殊培养基（罗氏）上才能生长良好。 懒--生长缓慢，14～18h分裂1次，在固体培养基上2～5w才出现肉眼可见的菌落。 丑--典型菌落为粗糙型，表面干燥呈颗粒状，不透明，乳白色或淡黄色，如菜花样。;结核分枝杆菌天然地对很多抗生素有抵抗力，使得治疗极其困难。该菌的药物抵抗力主要由于其具有高度疏水的细胞壁充当渗透屏障。同时，在基因组中还发现有许多药物抗性决定因子的编码序列，包括水解酶或者药物修饰酶，例如乙酰转移酶和很多药物外排泵系统。;目前结核杆菌常规检测方法; 痰涂片法阳性率低，且易受非结核杆菌的污染。 培养法目前认为是诊断的“金标准”但结核杆菌生长缓慢，不利于临床上的及时诊断和治疗。 血清学试验由于分枝杆菌属各菌之间抗原有着广泛的交叉，特异性不强。;TB H37Rv 全基因组为环状双链DNA，长约4 411 529bp，共有4000基因， G+C平均值65.6%，其基因序列高度保守。 H37Rv 基因组中有50 个编码功能RNA 的基因，其中 45 个 tRNA基因，3 个 rRNA 基因和 2 个核稳定（stable）RNA基因，这些 RNA分子是由特异的核糖体RNA 操纵子产生的。;TB H37Rv 基因组中共有3924个开放阅读框，其中91%有潜在的编码能力，ORF中最常见的起始密码子61%为ATG，35%为GTG。 187个ORF参与脂类代谢、细胞壁合成， 360个参与细胞壁代谢， 66个参与脂类合成， 287个参与能量代谢， 95个参与氨基酸合成， 38个与细菌毒力相关， 69个参与DNA合成。 所编码的蛋白约有40%的为功能性蛋白，44%的与已知蛋白有相似性信息，16%的则为未知蛋白。 TB不同菌株之间存在多个差异基因。 基因组中有3个毒力因子：mce、过氧化氢酶-过氧化物酶和sigA。除了这些单基因毒力因子，细菌的胞壁也对致病性起着重要的作用。;二、结核分枝杆菌的分子生物学检验内容 （一）结核分枝杆菌核酸的检测 可采用PCR、real-time PCR、PCR-RFLP、线性探针杂交、链替代扩增技术、扩增结核分枝杆菌直接试验、基因芯片技术、全自动结核检测平台等方法检测标本中的TB DNA。 1、 PCR PCR扩增所选靶序列主要有65kD抗原基因、MPB蛋白基因、rRNA基因、TB