《临床免疫学与检验》课件：第四章 单克隆抗体与基因工程抗体的制备.ppt

; 第一节 杂交瘤技术的基本原理 一、杂交瘤技术 二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存;第三节 基因工程抗体制备 一、人源化抗体　 二、小分子抗体 三、抗体融合蛋白 四、双特异性抗体 五、噬菌体抗体库技术; 第一节 杂交瘤技术的基本原理;抗体种类： 第一代抗体 多克隆抗体（polyclonal antibody) 第二代抗体 单克隆抗体（monoclonal antibody) 第三代抗体 基因工程抗体（genetic engineering antibody);B淋巴细胞:寿命短,分泌特异系性抗体 骨髓瘤细胞：寿命长 杂交瘤细胞：寿命长，单克隆抗体;流 程;不产生Ig的重链和轻链 HGPRT-;TK- 与提供淋巴细胞的动物品系相同; 动 物： BALB/c小鼠 7～12周龄 20g～25g体重;细胞性抗原： （1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次 可溶性抗原： 首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫;。;。;。;。;培养液： RPM1640培养液 DMEM培养液;细胞融合剂： PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合 作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同;培养骨髓瘤细胞： 选择对数生长期的细胞进行传代培养 细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐 避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞 注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于-80℃或液氮及干冰中;饲养细胞： 细胞密度过低不利于细胞生长繁殖 常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞 其中MQ还有清除死亡细胞的作用 饲养存活一般不超过2周，不影响杂交瘤细胞的纯化;。;骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3) 50% PEG 1min内加完; 2min内加10ml培养液;SP2/0细胞与脾细胞的比例为1：2～5 1ml 50%的PEG（无菌，预温37℃）在1分钟内滴完,静置90秒,时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止PEG作用 根据细胞数量加入HAT培养基，使之分加到96孔板中时每孔细胞数为（0.5～1.5）×105个。融合后7天，换用HT培养液;10～20天出现克隆 HAT筛选 挑克隆;HGPRT酶与TK酶： 次黄嘌呤磷酸核糖转化酶 胸腺嘧啶核苷激酶;HAT培养基： H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA;HAT选择作用： 淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断 骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻;SP2/O: HGPRT- ，TK-;　长命 脾细胞: HGPRT+ ，TK+ ;短命(7天) 杂交瘤细胞:HGPRT+ ，TK+; 长命;杂交瘤细胞： 长期生长繁殖 利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA 从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息 从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力;有限稀释法(limiting dilution) 显微操作法(micromanipulation) FACS法（fluorescence activated cell sorter） 软琼脂平板法(soft agar method);特点： 不需任何特殊设备 克隆出现效率高 实验室常用方法 方法： 细胞悬液通过系列稀释 每个培养孔含0.5～1个细胞; 效率最高 价格昂贵;配制方案：杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml) + 细胞冻存液(30%～40% 牛血清，50%～60% RPMI-1640培养液，10%DMSO ) “慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮? “快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、复苏;防止污染 避免染色体丢失 防止非分泌细胞的过度生长 防止细胞密度过高而死亡; 第二节 单克隆抗体的制备;一、单克隆抗体的产生;腹腔注射法;前5天进行,预先腹腔注射pristane （1～5）×106细胞 1～3w形成腹水;可溶性抗原：ELISA抗体捕获法 细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法（用丙酮和甲醇按1:1比例固定细胞）;ELISA;ELISA;多头加样枪;。;盐析沉淀 亲和层析 离子交换层析;Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法 特异性测定：抗原类似物的交叉反应 效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示? 表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞?争抑制法，相加指数法及微机集群分析 亲和性测定：测定亲和常数K