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第一节 杂交瘤技术的基本原理
一、杂交瘤技术
二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存;第三节 基因工程抗体制备
一、人源化抗体
二、小分子抗体
三、抗体融合蛋白
四、双特异性抗体
五、噬菌体抗体库技术; 第一节 杂交瘤技术的基本原理;抗体种类:
第一代抗体 多克隆抗体(polyclonal antibody)
第二代抗体 单克隆抗体(monoclonal antibody)
第三代抗体 基因工程抗体(genetic engineering antibody);B淋巴细胞:寿命短,分泌特异系性抗体
骨髓瘤细胞:寿命长
杂交瘤细胞:寿命长,单克隆抗体;流
程;不产生Ig的重链和轻链
HGPRT-;TK-
与提供淋巴细胞的动物品系相同;
动 物:
BALB/c小鼠
7~12周龄
20g~25g体重;细胞性抗原:
(1~2)×107/只,不加佐剂,2~3周重复一次
可溶性抗原:
首次,完全福氏佐剂+100微克抗原,3~6周100~200微克抗原,融合前3天,加强免疫;。;。;。;。;培养液:
RPM1640培养液
DMEM培养液;细胞融合剂:
PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂
作用机理:诱导细胞膜上脂类物质结构重排,使细胞膜易打开而有助于细胞融合
作用特点:随机发生的,不同厂商、批号、分子量的PEG,其纯度与毒性有所不同;培养骨髓瘤细胞:
选择对数生长期的细胞进行传代培养
细胞形态:浑圆、透亮、均一、排列整齐
避免细胞返祖:定期用8-AG处理细胞
注意事项:切忌过多传代培养,可将细胞分装冻存于-80℃或液氮及干冰中;饲养细胞:
细胞密度过低不利于细胞生长繁殖
常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞
其中MQ还有清除死亡细胞的作用
饲养存活一般不超过2周,不影响杂交瘤细胞的纯化;。;骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3)
50% PEG 1min内加完;
2min内加10ml培养液;SP2/0细胞与脾细胞的比例为1:2~5
1ml 50%的PEG(无菌,预温37℃)在1分钟内滴完,静置90秒,时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止PEG作用
根据细胞数量加入HAT培养基,使之分加到96孔板中时每孔细胞数为(0.5~1.5)×105个。融合后7天,换用HT培养液;10~20天出现克隆
HAT筛选
挑克隆;HGPRT酶与TK酶:
次黄嘌呤磷酸核糖转化酶
胸腺嘧啶核苷激酶;HAT培养基:
H(Hypoxanthine):次黄嘌呤
A(Aminopterin):氨基喋呤;叶酸拮抗物,阻断DNA合成主要途径
T(Thymidine):胸腺嘧啶核苷;“核苷酸前体”,供细胞通过替代途径合成DNA;HAT选择作用:
淋巴细胞:不能生长,5~7天死亡;DNA合成的主要途径被A阻断
骨髓瘤细胞:不能生长,5~7天死亡;HGPRT缺乏,DNA合成的替代途径受阻;SP2/O: HGPRT- ,TK-; 长命
脾细胞: HGPRT+ ,TK+ ;短命(7天)
杂交瘤细胞:HGPRT+ ,TK+; 长命;杂交瘤细胞:
长期生长繁殖
利用淋巴细胞的HGPRT,将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA
从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息
从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力;有限稀释法(limiting dilution)
显微操作法(micromanipulation)
FACS法(fluorescence activated cell sorter)
软琼脂平板法(soft agar method);特点:
不需任何特殊设备
克隆出现效率高
实验室常用方法
方法:
细胞悬液通过系列稀释
每个培养孔含0.5~1个细胞;
效率最高
价格昂贵;配制方案:杂交瘤细胞((1~5)x106/ml) + 细胞冻存液(30%~40% 牛血清,50%~60% RPMI-1640培养液,10%DMSO )
“慢冻”:分步冷冻,30℃→-70℃→液氮?
“快融”:取出立即浸入37℃~40℃水浴中,使其迅速融化、复苏;防止污染
避免染色体丢失
防止非分泌细胞的过度生长
防止细胞密度过高而死亡; 第二节 单克隆抗体的制备;一、单克隆抗体的产生;腹腔注射法;前5天进行,预先腹腔注射pristane
(1~5)×106细胞
1~3w形成腹水;可溶性抗原:ELISA抗体捕获法
细胞、亚细胞结构上的抗原:免疫荧光法(用丙酮和甲醇按1:1比例固定细胞);ELISA;ELISA;多头加样枪;。;盐析沉淀
亲和层析
离子交换层析;Ig类型、亚类测定:双扩法或ELISA法
特异性测定:抗原类似物的交叉反应
效价测定:用腹水或培养液的稀释度表示?
表位测定:几株单抗是否为不同表位特异的,用竞?争抑制法,相加指数法及微机集群分析
亲和性测定:测定亲和常数K
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