广西猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子生物学研究-预防兽医学专业论文.docxVIP

广西猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子生物学研究广西猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子生物学研究 广西猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子生物学研究 广西猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子生物学研究 摘 要 近来，广西一些养殖场频繁发生以母猪流产、死胎、木乃伊、仔猪呼吸道 症状等为特征的流行性传染病，怀疑为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)所致。 本研究应用针对PRRSV的N基因的特异性引物P1／P2，通过RT—PCR技术对从广 西南宁市郊区收集的仔猪病料进行检测，结果为阳性。将材料接种于易感细胞 一Marc-145细胞，经过6代盲传，结果出现了典型的细胞病理变化(CPE)，与 对照株病变相似，经鉴定为PRRSV，成功地分离出广西第一株PRRSV毒株，命名 为GXA株，其毒价为105”TCID。／ml。 参考VR-2332和cH一1a株基因序列，设计了3对引物El／E2、M1／M2、N1／N2， 分别扩增GXA株的E、M、N基因。并进行克隆和测序。结果分别扩增出大小为 668bp、582bp和443bp的目的片段。应用DNAstar生物学软件对所测得的序列 进行处理后，得到GXA株的E、M和N基因ORF全长分别为603nt、524nt和372nt， 分别编码200、1 74和123个氨基酸。将此3个基因序列分别与国内外已发表的 ATCC VR-2332、MLV、BJ-4和Lv等1 3个毒株相应基因序列进行了同源性比较。 结果发现GXA株与美洲型毒株E基因的核苷酸及其推定的氨基酸的同源性分别 为88．7—99．7％和93．8-1 00％，与欧洲型代表株一LV株的核苷酸及其推定的氨 基酸的同源性分别为64．7％和66．3％；GXA株与美洲型毒株M基因的核苷酸及其 推定的氨基酸的同源性分别为94．5-100％和96．6—100％，与LV株的核苷酸及其 推定的氨基酸的同源性分别为69．2％幂fl 78．9％；GXA株与美洲型毒株N基因的核 广西大学2004屈硕士毕业论文 广西大学2004屈硕士毕业论文 苷酸及其推定的氨基酸的同源性分别为93．8-100％和95．2-100％，与LV株的核 苷酸及其推定的氨基酸的同源性分别为66．3％和63．9％。同源性分析显示，GXA 株与VR一2332、MLV和Bd一4的同源性非常高，而GXA与LV同源性非常低。构建 的系统发育树分析，GXA与VR一2332、MLV及BJ-4株亲缘关系比较密切。从而表 明GXA株属于美洲型毒株，可能来源于疫苗株。 将GXA株的E、M、N基因从重组质粒pMD-E、pMD—M、pMD—N中亚克隆至原 核表达载体PET-32a上，构建了原核表达重组质粒PET—E、PET—M和PET-N，并 通过酶切鉴定，证实构建成功。 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 分离GXA株克隆测序 同源性 原核表达重组质粒 RESEARCH oN MoLECULAR BIOLoGY oF PoRCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS(PRRSV)IN GUANGXI ABSTRCT In recent，some pig farms in Guangxi occur frequently an infectious disease，which characters are abortion，death of embryo，mummified fetuses，and respiratory problems in piglet． Pathogen of the disease WaS considered as porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)．In this study，we identified that the sample collected from the farm in Narming was positive by RT—PCR with a pair of specific N gene primers of PRRSV．Based on it，permissive cells，Marc一145 cells were inoculated with the sample．After six blind passages，typical cytopathogenic effect(CPE)was observed on cells as well as the positive contr01．And PRRSV was positive in the cells and culture medium by RT-PCR．The first PRRS