实验2－柱层析技术分离纯化菠萝蛋白酶粗提液.ppt

一、实验目的 1 学习和理解蛋白质进一步纯化的各种柱层析技术的原理和实验技能。 2 理解和掌握葡聚糖（SephadexG- 75）柱层析技术原理和实验操作步骤。 二、实验原理 凝胶层析（Gel chromatography）是利用具有一定孔径的多孔凝胶作为固定相，把分子大小不同的物质分离开来的一种层析技术. 凝胶过滤（Gel filtration） 分子筛（Molecular sieve chromatography） 凝胶渗透层析（Gel permeation chromatography） 从流出次序的不同即可达到分离纯化蛋白质的目的。 小颗粒（小分子量）进入gel的孔内扩散，流动速度慢，后冼脱； 大颗粒（大分子量）不进入gel的孔内，滑动速度快，先洗脱。 （3）5%TCA（三氯乙酸）400mL 4、酶液浓缩 （1）透析袋处理（用于浓缩）：新买的透析袋，裁剪成所需大小，用加洗衣粉或洗洁剂的自来水浸泡煮沸10 min，镊子取出，用自来水漂洗干净，再用dH2O漂洗1-2次，即可使用。 （2）PEG（聚乙二醇）6000 七．实验步骤 （一）凝胶的预处理 1、凝胶（干粉）必须使用前在过量的溶剂中充分吸胀，一般多为dH2O、盐溶液或 buffer，放置室温较长时间，使之充分吸胀。 浸泡时间：根据交联度不同而异，G50需6h。 注意：不要过分搅拌，以防止颗粒破碎，防止破坏胶链结构。 2、用倾泻法出去混杂的小颗粒，重复3到4次，以防止粉末等物质塞住胶孔。 3、加热100℃溶胀，不同交联度，时间不同，G50需2h，可杀死细菌和霉菌，且可排除凝胶内包藏的气泡。 （二）柱的选择 1、为了防止分离受管壁效应的影响，一般应选用内径大于2.5cm的柱（本实验为2cm）或最好用直径为23cm的柱。 管壁效应：在柱管中心部位组分移动较慢，而在管壁周围移动较快，因而影响分离效果。 2、柱的长度通常为50～100cm：柱高50cm 适用于脱盐，柱高100cm，蛋白质分级分离较好。 一般说，柱越长，分离效果越好，但柱过长，实验时间长，且样品稀释度大，易扩散。反而效果不好 （三）安装设备 柱子、恒流泵、自动部分收集器，并调好流速。 主要看老师操作演示。 （四）装柱（最重要的操作步骤） 1、首先垂直的安装好玻璃层析柱， 出口的胶管不能留有气泡。 2、在柱中先装10mL的水，将已溶胀的凝胶沿着玻璃棒小心的徐徐的灌入柱中，让其自然下降以免出现不均匀的凝胶带。 3、装柱时需打开下口，并调节适当流速。 4、注意事项 （1）凝胶不能太稀或太粘稠，若太稀分几次装上的凝胶床往往不均匀，过于粘稠，会吸留气泡。 （2）凝胶柱床必须装得十分均匀。 （3）在任何时候不要使液面低于凝胶表面，否则凝胶变干，出现裂层，且有可能混入气泡，对蛋白分离不利。 （五）加样 1、凝胶沉集后，调整流速，加一滤纸或尼龙滤布于凝胶面上，以防止加样时，凝胶被冲起或不平。 3、接上恒流泵（注意：恒流泵速度不能太高或全速），继续用蒸馏水洗柱子，约0.5~1 h。 4、调整恒流泵流速，使每管4 mL，每6 min收集1管（4 mL/管/6 min）。 5、调整好部分收集器，使其转动的速度为1管/6 min。 6、加样量为层析柱体积的1.2%，如100ml体积，加样12ml，2×20cm的柱体积为62.8 ml，装柱体积50 ml，加样0.5～1.2ml。 7、用吸管取1～1.2ml粗蛋白溶液，小心的将样品加到凝胶床的表面滤纸上。 !注意： （1）加样时勿将床面凝胶冲起 （2）不要沿壁管加样（因为样品易从柱壁与凝胶床之间漏下） （3）打开出口管，待样品恰好进入柱后，用少量PBS洗一下凝胶表面和接触过样品的柱壁，待完全流入床后，再加PBS进行洗脱。 （六）洗脱 （1）洗脱液：0.1moL/L PBS pH7.8 （2）调节流速： 每管4ml，每6min收集1管 即4ml/管，6min/管 共收集20～25管。 （七） 实验检测和酶活测定 （1）用紫外分光光度计测各管的A280 （2）A280数值高（大于0.2）的管进行酶活测定A275 （3）把酶活及蛋白含量高的收集管的溶液混在一起，到入干净的透析袋，用聚乙二醇6000吸水，直到酶液浓缩到1ml，用吸管把酶取出，-10℃保存，留到下次电泳实验用。 总的实验流程 装柱（装柱时,柱内留10 mL 的水,倒入Sephadex G75，要求Sephadex G75均匀，大约1.5h） ↓ 调节流速4mL/管/6分（注意：恒流泵的转速不能太高） ↓ 加样:约1.2mL ↓ 收集管（收集20～25管） ↓ 用紫外分光光度计测各管的A280（蛋白含量测定） ↓ 九．实验注意事项： 1）Sep