大肠杆菌CRISPR-Cas9系统基因敲除简介.docx

--专业文档-可编辑-- -- 1 CRISPR-Cas系统的研究进展 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats) ，即串联的、间隔的短回文重复序列， 最早在 1987 年研究大肠杆菌的碱性磷酸酶基因时被发现 [1] 。随后在细菌和古细菌的基因组中也发现大量存 在 CRISPR，研究证实它能够保护自身抵御外来病毒和质粒的入侵 [2] ，作用机制是依靠 crRNA(CRISPR RNA) 和 tracrRNA(trans-activating crRNA) 结合并引导 Cas 蛋白对外源 DNA 进行特异性降解 [3] 。已发现的 CRISPR-Cas 系统有三种类型： Ⅰ型， Ⅱ型和Ⅲ型， 其中以Ⅱ型最为简单， 只需一种 Cas 蛋白，即通过 RNA 介导核心蛋白 Cas9 识别并切割靶序列，引起 DNA 双链断裂 [2] 。 受自然界中 CRISPR-Cas 系统的启发，主要对来自于化脓性链球菌 (Streptococcus pyogenes) 的Ⅱ型 CRISPR-Cas 系统进行人为改造和利用，目前已经将其发展成为一种新型的基因编辑技术，实现基因敲除、 插入、定点突变和组合编辑 [4]，并成功应用于大肠杆菌、酿酒酵母、家蚕、果蝇和人类细胞等 [5] 。和传统 的基因编辑技术相比，这一新技术具有成本低、操作简便、效率高的优点 [6] 。 2 CRISPR-Cas系统的组成与机制 典型的Ⅱ型 CRISPR-Cas 系统基因座包含 tracrRNA 基因、Cas 蛋白编码基因 (cas9、cas1、cas2 和 csn2)、 CRISPR 基因座（引导序列、间隔序列和重复序列）这三个部分 [6] 。 Ⅱ型 CRISPR-Cas 系统的作用机制可分为三个阶段，第一是高度可变间隔序列的获得（图 1），第二是 CRISPR-Cas 系统基因座的表达，第三是对外源遗传物质的降解 [6] （图 2）。 Cas1、Cas2 和 Csn2 蛋白与新间隔序列的获得相关。与间隔序列同源的外源遗传物质上的原间隔序列 (protospacer) ，其下游存在一段保守序列，被称为 PAM(protospacer adjacent motifs) [7] 。当外源噬菌体或质粒 首次入侵时，宿主菌通过识别 PAM，选取合适的原间隔序列，切割并整合到 CRISPR 基因座中，形成新的 间隔序列。 [8] 正常情况下 CRISPR 基因座的表达水平很低 ，但是当外源噬菌体或质粒再次入侵时， CRISPR 基因 座的表达水平快速上调， 首先转录形成前体 crRNA(pre-crRNA) ，随后在 tracrRNA 的指导下， 由 Cas9 和核 酸内切酶 RNaseⅢ加工为含有一个间隔序列和部分重复序列的成熟 crRNA 。 成熟的 crRNA 与 tracrRNA 形成 crRNA:tracrRNA 复合物，并结合 Cas9形成核糖核蛋白复合物， crRNA 上 的间隔序列与外源 DNA 的原间隔序列互补配对， 从而引导具有核酸内切酶活性的 Cas9对 DNA 双链进行特异性切割。 图 1 宿主菌获得新间隔序列的机制 [6] Fig.1 New spcacer of CRISPR acquisition 图 2 Ⅱ型 CRISPR-Cas 系统表达及降解外源遗传物质的机制 [6] Fig.2 Schematic of CRISPR/Cas9 mediated DNA double-strand break 3 双质粒 CRISPR-Cas9基因敲除系统 本实验中采用双质粒 CRISPR-Cas9 系统 [5] 对大肠杆菌进行 “无痕 ”基因敲除，涉及到的两个质粒分别为 pCas和 pTargetF（图 3）。该系统将 crRNA:tracrRNA 复合物融合为人工设计的 sgRNA(single guide RNA) （图 4），省去了将 pre-crRNA 加工为成熟 crRNA 的步骤，只需设计长度为 20 nt ，与靶序列互补的 N 20序列。 pCas包含cas9基因及其原始启动子，将 Cas9导向 pTargetF的pMB1 复制子的 sgRNA- pMB1 ，提高编辑效率的 λ-Red重组酶基因 (gam、 bet和 exo)，卡那霉素抗性基因 kanR和温敏复制子 repA101。 pTargetF包含 sgRNA 序列， N20序 列， pMB1 复制子和壮观霉素抗性基因  aadA。 首先向待敲除菌株中电转入 pCas，通过 L- 阿拉伯糖 (L-arabinose) 诱导，使重组酶 Gam、Bet 和 Exo 表达。 Gam 能与