华理微生物专业课课件8.ppt

2）枯草芽孢杆菌： 不存在潜在致病性，不产生内毒素，可将蛋白质分泌到培养基中，并且已有合适的质粒载体用于转化。 不足之处：质粒往往不稳定 3）酵母： 基因的表达调控以及蛋白质的翻译后加工比较接近高等 真核生物； 具有较高的安全性，用它表达生物药物时，不需进行 大量宿主安全试验。 4）动物细胞： 有关人类遗传学、肿瘤、感染性疾病和生理学的许多研究均需在动物细胞特别是哺乳动物细胞中进行。 细胞培养费用昂贵、难于操作； 克隆基因的表达水平极低； 离体定向诱变与蛋白质工程 蛋白质工程：通过对蛋白质结构和功能间规律的详细了解，按照人们预定的模式，人为地改变蛋白质结构，从而创造出有新奇性质蛋白质的过程 主要对关键性的氨基酸作人为的更改 以某个典型的折叠进行“从头设计” 蛋白质工程流程图 1. 从预期的蛋白质功能出发 2. 设计预期的蛋白质结构 3. 推测应用的氨基酸序列 4. 找到相应的脱氧核苷酸序列 设计分成三类 1.小范围改造:对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的替换，来研究和改善蛋白质的性质和功能 2. 较大程度的改造:对来源于不同蛋白质的结构域进行拼接组装，期望转移相应的功能 3.蛋白质从头设计 (de novo or abinitio protein design) 给定一个目标三维结构，要求找出与已知顺序无明显同源，能折叠成目标结构的氨基酸顺序来。 离体定向诱变技术 缺失突变 插入突变 碱基置换突变 寡聚核苷酸参入（位点定向诱变） 最早的蛋白工程是福什特（Forsht）等在1982—1985年间对酪氨酰—t—RNA合成酶的分子改造工作。 根据X衍射,实测该酶与底物结合部位结构，用定位突变技术改变与底物结合的氨基酸残基，并用动力学方法测量所得变体酶的活性，深入探讨了酶与底物的作用机制。 佩里（Perry）1984年通过将溶菌酶中Ile(3)改成Cys(3)，并进一步氧化生成 Cys(3)-Cys（97）二硫键，使酶热稳定性提高 显著改进了这种食品工业用酶的应用价值。 1987年福什特通过将枯草杆菌蛋白酶分子表面的Asp（99）和Glu（156）改成Lys，而导致了活性中心His（64）质子pKa从7下降到6，使酶在pH＝6时的活力提高10倍 工业用酶最佳pH的改变预示可带来巨大经济效益。 提高葡萄糖异构酶的稳定性　　 第138位甘氨酸(Gly138)为目标氨基酸 体外定点诱变，以脯氨酸（Pro138）替代Gly138，含突变体的重组质粒在大肠杆菌中表达，结果突变型GI比野生型的热半衰期长一倍；最适反应温度提高10～12℃；酶比活相同。 Pro替代Gly138后，可能由于引入了一个吡咯环，该侧链刚好能够填充于Gly138附近的空洞，使蛋白质空间结构更具刚性，从而提高了酶的热稳定性。 蛋白质活性的改变 胰岛素在高浓度（大于10－5mol/L）时以二聚体形式存在，低浓度时（小于10－9mol/L）时主要以单体形式存在。 类胰岛素生长因子－I(IGF－I)的结构和性质与胰岛素具有高度的同源性和三维结构的相似性，但IGF－I不形成二聚体。 IGF－I的B结构域（与胰岛素B链相对应）中B28Pro－B29Lys氨基酸序列与胰岛素B链的B28－B29相比，发生颠倒。因此，将胰岛素B链改为B28Lys－B29Pro，获得单体速效胰岛素。 胰岛素的一级结构及不同动物胰岛素在A链中的差异 * * 重叠基因中不仅有编码序列也有调控序列，说明基因的重叠不仅是为了节约碱基，能经济和有效地利用DNA遗传信息量，更重要的可能是参与对基因的调控。 * 表示：如hisC－或hisC （遗传型为his缺陷型） hisC＋ （野生型） HisC(表型为his缺陷型） * 表示：strr（遗传型为链霉素抗性） strs （遗传型为链霉素敏感性） * 蓝白筛选是验证是否有插入片断。（载体具有β-半乳糖苷酶基因lacZ，功能为β-半乳糖苷酶，在IPTG存在下将底物X-Gal转化为有颜色的产物，得到蓝色菌落。在载体的多克隆区域，克隆上插入片段导致α-肽编码区的破坏，使β-半乳糖苷酶失活，得到白色菌落。） * 只引起G：C 转化为A：T 因为它只作用于胞嘧啶 * 吖啶橙插入导致碱基的缺失突变 结合前面错义、移框的抑制突变－－－－－因此遗传学上鉴定突变型（突变类型）可用分别使用产生错义、移框突变的突变剂二次处理，看其回复突变的有无 * SOS修复是指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，故又称为错误倾向修复（error-prone repai