微生物优良菌种的选育.pptVIP

霉菌的杂交技术 　　诱变获具标记的亲本。 异核体的形成：基本培养基上，强迫进行 　　营养互补。还可用多种方法。 双倍体检出：可从扇面上挑孢子分离。 分离子检出：杂合二倍体单孢子平板分 　　离，检菌落斑点或扇面，斑点处挑孢 　　子至斜面，再纯化鉴别。 ４、酵母菌的杂交育种 双单特性：存在单倍体和二倍体的生活史 　　　　　二倍体生活力强，生产能力高，可 　　　　　　通过杂交得二倍体来育种。 方法：首先获得单倍体细胞；二倍体菌落大，椭圆形，可形成子囊。杂交。 　杂交方式：孢子与孢子交配；孢子与单倍体细胞交配；单倍体细胞间交配。 例：卡尔酵母，糖化酵母　 四、原生质体融合育种 1、基本概念 原生质体融合(protoplast fusion)：在高渗的条件下把两个亲本的细胞壁通过酶解瓦解，得到原生质体，并在助融合剂（如PEG，Ca，Mg离子）或电击的作用下使两个亲本的原生质体发生融合的过程。 原生质体：在高渗溶液中除去细胞壁的细胞。 2、原生质体融合育种的优势 没有供体和受体之分，适用面广，受亲缘关系的限制小；打破了微生物的种界界限，可实现远缘菌株的基因重组。 重组频率高； 遗传物质的传递更加充分 3、原生质体融合的步骤 革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖组成 溶菌酶 微球菌、枯草杆菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌 革兰氏阴性菌不能直接溶壁，只有当乙二胺四乙酸（EDTA）存在时，某些革兰氏阴性菌的细胞壁才能够被溶菌酶溶解。 金黄色葡萄球菌 溶菌酶不能溶解 表皮葡萄球菌能产生一种内肽酶——葡萄球菌素，溶解 放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌也可采用溶菌酶 真菌细胞壁主要由纤维素、几丁质和葡聚糖等组成 青霉菌多用纤维素酶和?-1,3-糖苷酶等溶壁 曲霉用?-1,3-糖苷酶和?-1,4-糖苷酶等 酵母菌细胞壁中的葡聚糖和几丁质 蜗牛酶 或者EDTA处理后 加细胞壁溶解酶 4、原生质体融合技术在微生物育种中的应用： 选育高产优质菌株 产生新的产物 五、基因工程育种 精确的定向育种，技术含量高，应用面广。 应用：解决了一些药物或材料来源困难，或制造技术复杂，或造价昂贵而无法大量生产和应用的问题。 1982年第一个基因工程产品-重组人胰岛素 （一）基因表达系统 从育种的角度考虑，最重要的是目的基因的高效表达。 　　　１.原核表达系统；２.真核表达系统． １、原核表达系统 原核生物不适宜表达需后加工处理的那一部分真核基因 不能切除mRNA的内含子； 不能进行蛋白质的糖基化； 不能对氨基酸进行修饰。 ①大肠杆菌：遗传背景清楚；基因操作简便； 　　　　　易培养，世代短，生长快；适宜大规模生产． 　　注意：真核蛋白后修饰； 多为胞内产物；产物分离纯 化困难；内毒素；蛋白酶破坏产物；免疫反应。 ②枯草芽孢杆菌：优点，分泌能力强；缺点， 胞外蛋白酶强． ③链霉菌：使用安全；分泌能力强。 ２、真核表达系统 产生的蛋白质与天然蛋白质具有一致的生理生化功能 ①酵母：真核生物蛋白质的优良表达系统 优点：基因组小，操作方便； 世代周期短，易培养； 有单、双倍体形式；能糖基化；能分泌产物到胞外。 应用：干扰素、乙肝表面抗原基因已经成功表达； 酿酒酵母研究、应用最广泛。 ②丝状真菌： 特点：能进行翻译后加工； 表达产物分泌能力强； 　　　　安全；发酵、纯化工艺成熟。 （二）利用大肠杆菌的基因表达系统 外源基因在大肠杆菌中的成功表达与表达载体、外源基因的调控序列等有关 １.表达载体 条件： ①能独立复制； ②有灵活的多克隆位点和方便的筛选标记，位点位 于 起动子后； ③有很强的起动子，能被大肠杆菌的RNA聚合酶识别； ④有使起动子受抑制的阻遏子，受诱导时才转录，可人 为的通过理化因素选择启动时机； ⑤有很强的终止子，使RNA聚合酶集中力量转录克隆 的外源基因；克服质粒高转录引起的质粒不稳定。 ⑥产生的mRNA须有翻译的起始信号，即起始密码 AUG和SD序列。 ２、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 目的基因的表达产量与每个细胞平均表达量 和细胞浓度正相关。 影响因素： ①外源基因的拷贝数； ②外源基因的表达频率： 　启动子的强度（转录水平）；　　起始密码子AUG和SD序列的间距；核糖体结合位