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流式细胞仪数据分析
5.1 数据采集及显示
光信号转换成电压脉冲后,再通过模数转换器转换成为计算机能够储存处理的数字信号。 流式细胞仪的数据以FSC标准格式存储,该标准由“分析细胞学协会”制定。
根据FSC标准,数据存储格式应包括三个文件:样本获取文件,数据设置文件和数据分析结果。 4参数(FSC,SSC,FITC和PE)的单细胞分析会生成8位数据。当单个样品累计收集到10000个细胞时,FCS数据文件为80kB。
数据采集存储完毕后,细胞亚群可以几种不同格式显示。单参数如FSC或FITC(FL1)可使用直方图,横轴表示荧光通道。纵轴表示在该通道内收集到的细胞数量(如图5-1)。处在同一通道的每一细胞均符合该通道的信号值,而且具有相同的信号密度。通道右侧信号的荧光强度明显高于左侧,越靠右侧荧光亮度越强。 图5-1 流式数据分析图
双参数可在二维散点图中同时显示,X轴显示通道1(FL1),Y轴显示通道2(FL2)。3维图通过X,Y,Z三个轴分别显示每个通道的细胞量(如图5-1)。
习题:数据采集及显示
1 在直方图中横轴和纵轴分别表示 。
2 二维点图用于显示 参数。
3 在CellQuest软件中3维图中Z轴代表 。
5.2 设门
通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。如:血样本是混合细胞群,如果想单独分析淋巴球细胞,可根据FSC或细胞大小,在FSC,SSC的散点图中设门,其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。 图5-2 全血样本中淋巴细胞亚群的数据分析图
习题:设门
1 设门的方法通常用于分析样本内的指定细胞。(对 错)
5.3 细胞亚群的数据分析
数据分析包括从点图中的list-mode文件中显示数据,然后统计点图中的细胞分布情况。如前所述,分别有几种形式的点图用于显示数据,而且可通过设门的方法区分指定的细胞亚群。 如图5-3所示,在淋巴细胞亚群周围设门,以单独分析或分选该亚群细胞。
图5-3 选定淋巴细胞亚群设门
门内细胞的数据结果可在随后的图中显示。在下面的实例中,我们将详尽阐述细胞亚群百分含量的不同分析方法。 我们可以通过单参数直方图,二维点图和三维图来分析结果。单参数直方图可定位边界,二维点图可设置象限标志。如果需要,还可以建立数据统计表以输出结果。 直方图可直观单个参数的细胞数量。阴性对照用于决定直方图中单参数的左右边界(见图5-4)。左图中M1为阴性对照峰。右图中M2为CD3 FITC阳性峰。
图5-4 阴性对照峰M1(NORM001)和CD3 FITC阳性峰M2(NORM002) 图5-5的统计结果表明,整个事件共记录了6000个细胞,门内淋巴细胞2891个。其中M1(阴性)细胞619个,M2(CD3阳性)细胞2272个细胞。淋巴细胞亚群CD3阳性百分含量的统计结果为:M2:2272/2891=78.59%。
图5-5 直方图统计结果
二维点图以双参数显示结果,每个点表示一个或多个细胞。图5-6为阴性对照图,用于设定阴性对照边界,全图划分为四个象限,以区分阴性细胞、单阳性细胞以及双阳性细胞。左下象限(LL)为双阴性细胞,左上象限(UL)为Y轴阳性细胞(CD19 PE),左下象限(LR)为X轴阳性细胞(CD3 FITC),右上象限(UR)为双阳性细胞(CD19+/CD3+)。
图5-6 阴性对照组(NORM001)和CD3 FITC/CD19 PE双染样本(NORM002) 如图5-7所示,淋巴细胞亚群双阳性细胞(CD19+/CD3+)的百分含量为:296/2839=10.43%。
图5-7 散点图统计结果 另一个分析方法是划定区域,也就是设门。我们可以用不同形状的绘图工具定义所选区域(如图5-8所示);然后统计该区域内指定细胞亚群的百分含量。在图5-9中,R4门内为CD4阳性,CD3阴性的淋巴细胞亚群,其结果为:40/2866=1.40%。
图5-8 CD3 FITC/CD4 PE 双染样本分析图 图5-9 CD3 FITC/CD4 PE 双染样本数据统计结果
这种方法在分析不同的供体细胞时存在一个缺陷,因为如果事先定义好细胞亚群的区域或边界,在随后的文件中,下一个样本的细胞亚群位置会发生变化,这就需要操作者重新调整区域或边界位置。 为避免这种情况的发生,我们采用一种称为集群分析(cluster analysis)的新方法。BD公司的MultiSETTM 和AttractorsTM软件就属于集群分析软件。该软件的特点是会随着整个细胞亚群的移动而移动,自动变换区域或边界到相应的细胞亚群位置(见图5-10)。
图5-10 使用Attractors分析软件时二维点图的前后变化对比
5.4 流式细胞仪的其它应用以及数据分析
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