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第八章 基因工程 （1）大肠杆菌噬菌体 （2）基因组DNA全长6.5kb（单链） （3）感染后，可复制成双链DNA（RF，DNA） （4）当RF→100—200后，只有（+）链复制 4种常用载体的比较 P146 表8—2 筛选：蓝白筛选 3、 M13噬菌体（M13 phage） 在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载体。 二. 表达载体（expressing vector） ㈠ 大肠杆菌表达载体 除克隆载体的特性外还含有： 表达系统元件 启动子 核糖体结合位点 克隆位点 转录终止信号 启动子：常用的有 trp-lac启动子（or tac启动子） ?噬菌体Pc启动子 T7噬菌体启动子 除含有原核序列：在E-Coli中的复制起始点、便于筛选的抗性基因 还包括真核表达元件 启动子/增强子 克隆位点 终止信号和加poly（A）信号 ㈡哺乳动物表达载体 原核受体 E-Coli受体系统 外源基因复制、扩增场所 链霉菌受体系统 外源基因表达场所 酵母菌受体系统 真核受体 动物（哺乳）细胞受体系统 一般只作基因表 植物/ 昆虫细胞受体系统 达场所 基因工程的受体系统 1. 特点：①遗传背景清楚——利于研究 ②繁殖快——易获得大量基因产物（20’一代） ③含质粒——利于基因转移 ④表达非E-Coli基因，其潜力几乎是无限的 —. E-Coli受体系统 2. 缺点：①高水平表达基因产物易沉淀、凝集、不易折叠 ②基因产物纯化工艺复杂 ③基因产物易受污染（内毒素） ④基因产物对受体菌有毒害作用 ⑤基因产物易被水解 ⑥从安全角度——并不理想 ⑦缺乏基因产物表达后加工机制 特点：①安全性大 ②遗传信息和生理状况更适合于真核基因表达 ③基因产物外分泌 遗传背景较清楚 具基因表达后加工机制 二. 酵母菌受体系统 ⑴目的基因的获得 ⑵载体的选择与制备 ⑶目的基因与载体的结合（DNA分子的体外连接） ⑷重组DNA导入受体 ⑸重组体筛选和鉴定 ⑹目的基因表达 ⑺基因产物的分离纯化 第三节 重组DNA技术的基本过程 七步： —. 目的基因的制备 方法： 1. 内切酶法 2. 机械力降解 3. 化学合成 4. cDNA合成 5. PCR制备法 6. 从基因文库中提取 1.限制性内切酶法（鸟枪法或散弹法） 用酶降解染色体DNA（esp原核生物），将降解的DNA克隆到载体上，从而得到目的基因 优点：原理简单，操作简便，具有一定的应用范围。 缺点：随机性有限，盲目性大，筛选麻烦，应用范围有限 （只适用于原核生物） 2、机械降解法 优点：随机性大 缺点：所得基因片段不能直接连接，需加工修饰。 用超声波震荡等机械法使DNA断裂。 3. cDNA合成 cDNA文库（Cdna library）：将一个细胞中，所有cDNA都与载体连接成重组DNA，并列入宿主细胞进行扩增，得到分子克隆的混合体，称为cDNA文库。 cDNA的获得： 图8—5 七年制P149 不同细胞，不同细胞状态，得到的cDNA文库不同。 4. PCR（polymerase chain reaction） 3、化学合成法 a.a→code→DNA→化学合成nt 5.从基因文库中提取 基因文库（genomic library）：因限制性内切酶将基因组 DNA切成片段，每一段与一个载体连接成重组DNA，并引入宿主细胞进行扩增，得到分子克隆的混合体，称基因文库。 1. 粘性末端连接 5′—末端连接（易） 3′—末端连接（难） 二. 载体的选择和制备 分离纯化 三. DNA分子的体外连接 （外源DNA与载体连接） P与—OH形成二酯键 T4连接酶：载体经酶切后，易自身环化，形成自身载体。 处理方法之一：碱性磷酸酶处理5′—P 2