广州地区肠道病毒71型感染的分析-临床检验诊断学专业论文.docxVIP

硕士学位论文广州地区肠道病毒7l型感染的研究 硕士学位论文 广州地区肠道病毒7l型感染的研究 硕士研究生：方焕生 指导教师：姚英民、谢健屏 摘要 研究背景 肠道病毒71型(EV71)是小RNA病毒科肠道病毒属成员，其核酸为单股正旋 RNA，通过检测VPl序列即可将EV71与其他小RNA病毒区别开来。EV71可 引起手足口病(HFMD)、脑干脑炎、无菌性脑膜炎、脊髓灰质炎样麻痹、疱疹 性咽峡炎、神经源性肺水肿、肺出血、病毒性心肌炎等多种疾病。自从1974年 Schmidt等人首次报道从美国加利福利亚表现神经系统疾病的患者中分离到 EV71，EV71已在世界范围内引起十多次爆发和流行，导致数十万名儿童感染， 有数千入死亡。90年代后期，EV71开始肆虐东亚与东南亚地区，日本、马来西 亚、新加坡陆续报道了EV71感染。根据病毒衣壳蛋白VPl核苷酸序列的差异， 可将EV71分为三个基因型：A、B和c型。我国自1987年在武汉分离出首例 EV71感染毒株以来，其后上海、深圳、重庆、厦门、台湾、香港等地陆续报道 EV71感染。尤其是1998年台湾发生了10余万例EV71所致手足口病的大流行， 具有很强的神经毒性倾向，其中400余名儿童发生了严重的合并症，包括脑炎、 无菌性脑膜炎、肺水肿和肺出血，死亡78例：2000年台湾又暴发EV71所致手 足口病，8万余人患病，有41人死亡。综上所述，目前EV71感染仍然是全球 威胁性较大的病毒性疾病之一，尤其在东南亚其危险性更大，但到目前为止， 病毒的变异较大，其不同型别或同一型别在不同时间、不同地区乃至不同个体 引起了不同的临床表现， EV71众多的病毒型别是怎么形成的，其基因组测序 的结构的差别和病毒功能的关系是什么尚不清楚。令人担忧的是EV71具有比脊 髓灰质炎病毒更广泛的神经毒性，中枢神经系统受累是其感染的严重并发症， 可导致死亡，但导致神经毒性与病毒基因型的确切关系尚不清楚，目前还没有 中文摘要安全有效的疫苗来预防EV71的感染。中国地域广大，EV71流行特点与规律尚 中文摘要 安全有效的疫苗来预防EV71的感染。中国地域广大，EV71流行特点与规律尚 未掌握，我国EV71毒株与国外的病毒株和临床表现存在差异，其机制尚不清楚。 广州地区是中国的南大门，是我国对外交往的前沿城市，也是港澳台和国外各 种传染性疾病传播扩散的第一站。为防止发生1997～1998年在东南亚包括我国 台湾的大规模暴发和流行，监测广卅I地区的EV71流行株与外地输入株，探讨 EV71神经毒性与病毒基因型和的关系其意义是十分重大的。 本研究目的 1．调查我国广州地区2004年1—12月份肠道病毒71型(Ev71)感染率；了解 本地区EV71感染的流行病学特征；分析近年来我国以及广州地区EV71的病毒基 因型和亚型分类，为鉴定广卅I本地株与国内外输入株打下基础，为我国EV71疫 苗的研制提供本地区第一手资料。 2．从分子水平和细胞水平研究EV71对不同组织和器官的易感性差异，初步 探讨EV71不同临床类型(尤其神经毒性)与病毒基因型、细胞亲嗜性之间的关 系。 方法 1．对患有手足口病、肺炎、无菌性脑膜炎、脑炎、心肌炎、疱疹性咽峡炎 及下肢无力、走路跛行的儿童取咽拭子分泌物、水疱液、大便、脑脊液接种到 Vero细胞，放37。C、5％C02培养，全部病毒分离可疑肠道病毒阳性的毒株、部分 阴性毒株及原始标本提取毒株核酸RNA，进一步用EV71特异引物EVl59和 Evl62进行RT-PCR，扩增的VPl节段进行测序。所得序列与我国广州、深圳、上 海、武汉、台湾地区的EV71流行株，以及美国、日本、匈牙利、韩国、马来西 亚等国家地区的EV71毒株的核苷酸序列进行比对分析，构建种系进化树。分析 近年来我国以及广州地区EV71的病毒基因型和亚型分类。 2．随机选择已知VPl节段序列的广州地区4例手足口病患者和2001年广州地 区2例神经系统感染患者(脊髓灰质炎样麻痹)分离的EV71病毒株共6个，以100 个TCIDso接种非洲绿猴肾细胞(Vero)、人神经母细胞瘤细胞(sK-s—SH)、人喉鳞 Ⅱ 硕士擘位论文状细胞癌细胞(H印一2)，在光学显微镜下观测细胞病变，按细胞病变的程度予以 硕士擘位论文 状细胞癌细胞(H印一2)，在光学显微镜下观测细胞病变，按细胞病变的程度予以 分度，并采用实时荧光PCR进行病毒拷贝数检测、绘制病毒复制生长曲线。比较 两种完全不同的临床类型(强噬皮肤性和噬脊髓神经性)毒株，对不同组织来 源的细胞株亲嗜性的差异。 结果 1．2004年全年收集421例患儿中分离出可疑肠道病毒感染38例，肠道病 毒分离率为9．03％(38／421)，在肠道病毒感染38例中，检出EV71病毒13例， 阳性率为34．21％(13／38