蛋白质生化技术课程实例.pptVIP

实验步骤 原核表达并纯化GST融合的已知蛋白。 同时，应用放射性同位素（ 35S）对细胞裂解物进行标记。 将GST融合蛋白与标记好的细胞裂解物混合，同时加入谷胱甘肽偶联球珠，温浴使得融合蛋白的GST能够与球珠结合。 通过离心方法收集GST融合蛋白以及与其结合的可能的蛋白分子 。 在收集到的混合物中加入谷胱甘肽或者直接煮沸，使得目的的混合物能够从球珠上洗脱下来，溶解在SDS上样缓冲液中。 将获得的混合物进行SDS电泳，进行放射自显影或者蛋白染色，进而转膜进行Western blotting 实验鉴定。 还可应用质谱的方法对找到的结合蛋白进行分析，确定未知蛋白的氨基酸组成，从而找到与已知蛋白结合的因子。 Protein Biochemistry Lab Nankai University 应用 确定融合蛋白与未知蛋白间新的相互作用 证实融合蛋白与已知蛋白质间可能的相互作用 Protein Biochemistry Lab Nankai University GST Pull-Down检测蛋白的作用 原核表达的已知蛋白 细胞裂解液中的未知蛋白质 应用cDNA文库，进行体外翻译的蛋白质文库中的未知蛋白 半定量检测蛋白与蛋白的亲和作用 Protein Biochemistry Lab Nankai University GST Protein X GST 35S-labled ce