徕卡显微镜STED样品制备与快速指引.PDF

徕卡显微镜 STED 样品制备与快速指南 本指南的目的是作为一个快速参考指南最常见问题关于样品的准备徕卡SP8 TCS 发生的3 倍,通过介绍所需的理论 基础样本受激发射损耗 。 它提供了最常见的信息免疫荧光标记技术, 越来越多的媒体工作, 基本质量优化程 序和实验设计 。它还包含一个详细的列表,试剂、抗体和一次性用品经常成功地用于超分辨率发生的显微镜。 总 之,本指南是为了现在的必要的知识,包括一些提示和技巧,为用户准备他们的第一个超分辨率显微镜样品。 指导的重点设置Leica TCS SP8 STED 3X 与592 and 660nm STED 激光 受激发射损耗（STED ）显微镜是基于荧光共焦成像，其中图像是通过扫描形成聚焦光点在感兴趣的区域，并且通 过像素收集的荧光顺序像素获得的超分辨率方法。该技术的主要优势有： 1. 横向分辨率没有任何额外的后处理低于50 nm 涡流环室 2. 内在的共焦光学切片，用涡甜甜圈时，使收购约500 纳米的平面，三维结构，甚至几十微米深层组织内的 3. 使用z 轴分辨率低于130 nm 甜甜圈 4. 到水平和分辨率提高空间分布于感兴趣的样品/应用单独匹配的能力 5. 每秒几个图像的快速图像采集 6. 通过使用荧光蛋白或其他荧光标记活的成像能力 7. 能够选择的荧光在很宽的光谱范围由几个不同的激光器受激发射损耗在一台仪器启用 步骤1:选择样本  受激发射损耗可以在一个大的各种样品的应用，从单一培养的扁平细胞，组织切片，以整体动物，如线虫（线虫） 和昆虫（果蝇）。尽管如此几点应该加以考虑。受激发射损耗应用专门开发的受激发射损耗100X /1.4 油浸物镜， 其中有90 微米的工作距离。因此，所观察到的结构应该是至多80 微米远离护罩玻璃，但优选在20μm 的范围内 以获得最佳性能。另外，为了达到最佳的效果，在安装介质的折射率应当与所使用的浸没的索引（浸渍液=1.518， 也见步骤5）。目前在我们的投资组合干浸的物镜。  该结构必须是光学上可访问的。自发荧光，折射率的突然和不可预测的变化（如含有空气，髓鞘和脂肪组织）可 影响焦斑的形状和显微镜的结果的性能。如果与结算解决方案的经验是可用的，它可能是值得的测试。  在STED 成像，样品在592 纳米或660 纳米的波长照射强光。这是该试样没有在这些波长处吸收光至关重要。 步骤2:选择荧光团 有一个广泛的徕卡STED 显微镜表现良好的荧光基团（如见附录A ）。为了达到几个小时，在这一个系统示范正常 范围内实现了令人满意的结果，最好是留在荧光徕卡提出的保留节目。如果这是不可能的，荧光团应选择，它们具 有相似的激发和发射光谱的建议染料。这也有利于入手单色染色和，一旦这些被批准，转移到多色实验。请参阅附 录B 和C 的推荐荧光体组合多色实验，它不需要额外的光谱分离。对于受激发射损耗，以提高工作效率，无论是 荧光的发射光谱需要显示的受激发射损耗波长显著发射（见例之星440SX 和俄勒冈绿488 在下面的图）。 为了使染料和类似的排放不同激发的光谱分离是必需的。为受激发射损耗与592 纳米，这是通过使用大的斯托克斯 位移染料（BD V500，STAR440SX，STAR470SX）与位于更远的频谱的左边吸收光谱，比常规染料的吸收光谱 常常实现。 它主要是能够包括额外的染料为更多的颜色。门控受激发射损耗技术使染料与可敬的决议（显著低于80 纳米）的 受激发射损耗相同波长的显著不太严格的选择。这最终使得与592 线受激发射损耗（如星440SX，俄勒冈绿488 和Alexa Fluor532 ）三色标记成像。门控受激发射损耗三色成像三个标准染料与660 激光受激发射损耗（如Alexa 的488 ，将Alexa Fluor532 和TMR ）的实现。 STED 显微镜提供了最可靠的超分辨共定位数据。受激发射损耗甜甜圈/行确定的荧光可以被去除，因此该通道可以 被视为本质上一致。当然，人们也可以依次用几个STED 行工作，以达到最佳的可能的解决方案对于给定的荧光团， 但对于完美的共定位数据，这可能需要修正，因为它们是为其他的超分辨率技术必需为好。 另外其他的荧光标记物可被用作counterstainings 用共聚焦分辨率。这些染料的发射，然而，应该驻留的受激发射 损耗检测的范围，能够以其他方式与STED 图像质量干扰之外。此外，它很可能是这些染料将吸收强STED 消耗光 并得到漂白。因此，所有的参照图像应受激发射损耗图像之前被收购。 注意，使