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实验室常用载体介绍 载体构建的基本原理 1. TA克隆 (T4连接酶) Promega 的T-easy载体（pGEM -T Easy ） TAKRA T载体(pMD18-T ) 2. TOPO TA克隆(pCR8/GW/TOPO) 定向克隆(pENTR) 3. 酶切连接 实验室常用 4. Gateway 技术 TOPO异构酶 Gateway? 技术基于清楚了解的λ噬菌体位点特异重组系统(attB+attP ；attL+attR)。BP反应是DNA片段或者包含attB位点的表达克隆与包含attP位点的供载体（donor vector）之间进行的反应。BP反应产生入门克隆。 LR反应是含attL位点的入门克隆和包含attR位点的目的载体之间的重组反应。LR反应产生表达克隆。表达克隆包含目的基因和目的载体特异的启动子或者一些元件。 Gateway attB引物 attB1 5’ - GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTNN - 3’ attB2 5’ - GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTN - 3’ 酶切连接载体 超表达 pCAMBIA2300S 启动子 pBIN m-gfp5-ER和pBI121 Gateway技术载体 超表达 可能都要做融合蛋白了，与gfp或者his标签，这样以后就可以做WESTERN了。这边他们的超表达都是做的融合蛋白，不过要事先确定融合基因放在５‘还是３’，免得影响其功能。如果不确定就两种同时做。 RNAi 启动子 启动子（截短策略） 棉花自己的启动子？？？ 诱导表达 loxP 34bp CRE gene Glucocorticoid GR intron EGFP 效率低的问题： 连接反应效率低？ BP、LR反应效率低？ 转化效率低？ 切记抗生素 邓锋林负责载体的保管 谭家福负责相关酶的管理 每个人只给划平板 转基因过程中的注意事项 大小皿及滤纸不能混用 转基因的共培皿及一些摇菌的三角瓶灭完菌再洗 转基因所挑的克隆块，每个克隆块分化苗的棵数 烟草转基因的假阳性问题（抗生素） 拟南芥的转化 公共卫生：到完皿之后， 继完代之后，配完培养基之后 转基因苗移栽 * Gateway? 技术 1. 创建入门克隆，通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。 2. 混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体及Gateway? LR Clonase?酶，产生表达克隆。 致死基因：DB 3.1 Proline rich protein like protein (PRPL) Sense primer GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGAACATAAGCCCCCTGTC Antisense primer GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCATAAGCACTCTCGCTAGT pGWB401 pGWB501 pGWB402 pGWB502 pGWB402Ω pGWB502Ω attL1 attL2 pDONR201+promoter 怎么工作的？ 我们怎么用？ 可以用在哪些地方？ *