家蚕杆状病毒bm64基因功能研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

浙江理工大学学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 浙江理工大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的 研究成果，也不包含为获得浙江理工大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示 谢意。 学位论文作者签名： 签字日期：≯莎年 渤” 辛≯¨ 舅日 万方数据 学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解浙江理工大学有权保留并向国家有关部门或机构送交本论 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解浙江理工大学有权保留并向国家有关部门或机构送交本论 文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙江理工大学可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印成扫描等复制手段保 存、汇编学位论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：滔蔑蓼 签字日期：尹步年扣f 1日 导师虢弘妒 签字日期：矿步年多月，匆日 万方数据 本研究由国家高技术研究发展计划“863项目 本研究由 国家高技术研究发展计划“863项目 (No．20 1 1 AA 1 00603) 提供资助 万方数据 浙江理工大学硕士学位论文 浙江理工大学硕士学位论文 家蚕杆状病毒bin64基因功能研究 摘要 家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus，BmNPV)属于杆 状病毒科核型多角体病毒属。家蚕核型多角体病毒(以下简称家蚕杆状病毒)是 感染家蚕的重要病原体，我国家蚕养殖业每年因此遭受巨大经济损失。对于家蚕 杆状病毒基因功能的探索是近些年来研究热点之一，但是依然存在很多功能未知 的基因。 本研究就家蚕杆状病毒的功能未知基因bm64开展研究。通过对NCBI上发 布的BmNPV(T3株)全序列(GenBank No．L33180．1)，进行生物信息学分析， 寻找bm64基因序列并进行比对和结构域预测。结果表明bm64与AcMNPV同源 序列的同源性高达95％，Bm64蛋白含有一段疏水结构域(62～84 aa)。通过构建 pGEX．4T．3．bm64，转化至Rosetta菌株，诱导表达Bm64蛋白，亲和纯化该蛋白 作为抗原免疫新西兰大白兔，获得多克隆抗体。使用该抗体成功检测到BmNPV 感染BmN细胞后产生Bm64蛋白。通过间接免疫荧光检测发现BmNPV感染细 胞后Bm64蛋白主要定位于细胞核内。因此，推测bm64基因可能在病毒DNA 复制和转录过程中起一定的作用。通过实时定量PCR对该基因的转录时相进行 检测，发现bm64基因的转录时相与晚期基因vp39相似，推测该基因为晚期基 因。为阐明bm64基因功能，利用Red同源重组系统和Bacmid杆粒构建bm64 缺失型重组杆状病毒，探索其基因缺失对病毒复制的影响。通过Bac．to．Bac系统 将bm64基因及其启动子进行异位补回，构建基因回复的重组杆粒。将egfp与 砌基因通过Bac．to．Bac系统重组入Bacmid中，构建三种不同Bacmid(Bacmid． egfp-ph、Bacmid一么bm64·egfp-ph、Bacmid-bm64rep-egfp—ph)。Western Blot验证 基因缺失重组病毒不表达Bm64蛋白。将三种杆粒转染细胞，发现bm64基因缺 失后重组病毒导致细胞病变的时间明显延迟，而TCID50检测也表明病毒滴度下 降，而基因补回的重组病毒感染细胞后的病毒滴度达到野生病毒水平。因而，推 测bm64基因是病毒复制的非必需基因，但是bm64基因在病毒复制感染中起重 要作用。Real．time PCR检测显示bm64缺失的重组杆状病毒的早、晚、极晚期基 因ref-3、vp39、plO转录水平均有不同程度的降低。 万方数据 浙江理工大学硕士学位论文 浙江理工大学硕士学位论文 家蚕杆状病毒bm64基因功能研究 本研究对bm64基因的转录时相、原核表达和亚细胞定位等方面进行研究， 通过对基因缺失的重组杆状病毒进行病毒滴度、病毒DNA复制、转录及蛋白表 达检测，推测bm64基因能影响病毒复制，是病毒复制的非必需基因，其确切机 制有待深入研究。 关键词：家蚕杆状病毒；bm64基因；基因功能； II 万方数据 AbstractBombyx Abstract Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV