鸡传染性支气管炎病毒非结构蛋白nsp5的重组表达-预防兽医学专业论文.docxVIP

浙江大学硕士论文 浙江大学硕士论文 摘要 摘 要 传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)是鸡传染性支气管炎 病的病原体，该病的流行导致了养禽业严重的经济损失。该病的临床疾病形式多样化和 血清型繁多，这给防制传染性支气管炎增加了难度。本研究的目的是利用大肠杆菌表达 系统和Bac-To-Bac杆状病毒表达系统表达传染性支气管炎的nsp5蛋白，为寻找IBV的 有效检测方法奠定基础。 以IBV-SC021202毒株为模板，利用特异性引物，通过PCR方法扩增nsp5的eDNA 片段，并分别克隆到原核表达载体PGEX．4T-l和pET-28a(+)qb。重组表达载体转化大肠 杆菌BL21(DE3)，在IPTG诱导下进行表达。SDS．PAGE和Western blot分析表明，nsp5 在PGEX．4T-l表达系统中是以可溶性形式表达，而在pET-28a(+)中以不溶性的包涵体 形式表达，GST-nsp5蛋白的分子量约60kDa，His．nsp5蛋白的分子量约37kDa。将两种 带标签的nsp5蛋白用亲和层析方法纯化后免疫小鼠，IFA和Westem blot检测显示，小 鼠血清不与自然的nsp5蛋白反应。 将传染性支气管炎病毒nsp5基因插入到pFastBac HTA转移载体中，构建重组转移 载体pFastBacHTA．nsp5。将pFastBacHTA．nsp5转移载体转化到含有Bacmid的E．coli感 受态细胞中，在细菌的Tn7转座子作用下使转移载体与存在于感受态细胞中的杆状病毒 基因组发生转座反应，形成重组杆状病毒载体Bacmid．HTA．nsp5。质粒转染Sf9细胞后， 可以通过间接免疫荧光试验与Western blot试验证实，表达的蛋白与抗nsp5蛋白小鼠多 抗血清发生特异性反应。 关键词：传染性支气管炎病毒：nsp5；原核表达；杆状病毒表达； 浙江大学硕士论文 浙江大学硕士论文 ABSTRACT 刘然2010 ABSTRACT Infectious bronchitis virus(IBV)is the pathogen of avian infectious bronchitis disease(IB)， which has caused serious financial losses in poulty industry．Clinical diversification of lB and different phenotypes of IBV sera challenge to the prevention and treatment for IBV．The study aimed to explore an available and simple detection method for IBV using different expression systems of the E．coli and Bac-To—Bac baculovirus． The present study performed to amplify eDNA of nsp5 with auele specific primers by PCR according to IBV-SC02 1 202 template，and then to insert them into a bacterial expression vector of PGEX一4T-1 and pET-28a(+)．Moreover，BL2 1(DE3)was constructed to expression vector in E．coli induced by IPTG．The results of SDS—PAGE and Western blot showed that nsp5 expression was induced in fusion form by PGEX-4T-1，but the form of inclusion bodies by pET-28a(+)，concomitant with GST-nsp5 weighting 60kDa and His-nsp5 weighting 37kDa．Then，the different pured and marked nsp5 protein was respectively to use in immune mice，and the IFA and Western blot assay also showed the