显微镜的原理和使用.docxVIP

光学显微镜的原理和应用 简 介 一、光学显微镜发展历史与最新进展 已近400年的历史。十九世纪之前发展非常缓慢。 1665年：英国物理学家R.Hoock的第一台显微镜的 雏形。 十八世纪初：慧更斯目镜的发明。 十九世纪中：Lister和Amici制造了消色差物镜，部分消除了色差，后者首次制成水浸物镜， 使数值孔径NA1。 1886年：Ernst Abbe与Carl Zeiss第一个生产出了复消色差物镜,消除了球差和色差的干 扰，提高了数值孔径(1.4)，并奠定了现 代光学理论原理。 1893年： August K?ler教授发明了著名的 柯勒照明 。 1890-1899年：金相显微镜、消像散透镜和双 筒目镜以及第一台体视显微镜 的诞生 。 二十世纪初：出现了齐焦物镜 。 1932年底： 诞生了透射电子显微镜，电子显微镜的分辨率是传统光学显微镜的1000倍以上。 1930－1940年：显微分光光度计的出现，预示着显微定量技术的开始。 1940－1950年：出现了荧光显微镜。 二次大战之前：Zeiss公司基于诺贝尔奖获得者荷兰物理学家Frits Zernike 的光学理论制 造了第一台观察活细胞的相差显微镜。 1955年： 物理学家Georges Nomarski改良了Wollaston棱镜，诞生了另外一种增强 活细胞反差技术的显微镜－Nomarski干涉显微镜即微分干涉差显微镜。 1975年： Robert Hoffman又提出了一种增强活细胞反差的技术，即Hoffman调制相差显微镜。 1970－80年：医学图像处理与分析系统 1970－80年：流式细胞仪 1980－90年：诞生了激光扫描共焦显微镜。比普通光学 显微镜的分辨率提高了1.5倍。 80年代末和90年代初：诞生了双光子扫描显微镜。 二十世纪90年代末~至今：全内反射显微镜，物镜数值孔径达到了1.6。 分辨率： 普通光学显微镜：xy- 0.25 mm 共焦显微镜：xy- 0.18 mm，z- 300nm 全内反射显微镜 ：z- 100nm 4pi：z100nm STED：xy- 20nm 透射电镜：xy- 0.1nm 二、生物光学显微镜主要种类： 眀场透射光显微镜: 观察经过组化染色的标本。 暗视野显微镜：适于观察未染色的标本－活细胞。 散射光成像。 相差显微镜： 适于观察活细胞。光相位差转换成振幅 差。 微分干涉差显微镜: 适于观察活细胞。利用双束偏振光的干涉增强反差。 荧光显微镜： 观察标记了荧光探针的样品（活细胞或 固定样品）。 偏振光显微镜： 利用偏振光观察晶体结构或具有双折射性的结构，如: 细胞骨架、纤 维、膜。 Hoffman调制相差显微镜：观察活细胞 三、光学显微镜的基本组成 光学显微镜主要由光学成像部分和机械结构部分组成。 光学成像：物镜、目镜、照明系统、滤片系统 机械结构：镜座、镜臂、载物台、镜筒、 物镜转换器、调焦装置 光学成像部分： （一）物镜 1．组成和作用：由凹凸透镜组成，直接使样品成放大倒立 的实像（放大1~100倍）。物镜品质的好坏、档次的不同决定了整个显微镜的质 量。 2．分类 1）按介质不同分类： 干燥物镜（简称：干镜）（空气n=1） 油浸物镜（简称：油镜）（油n=1.515） 水浸物镜（简称：水镜）（水n=1.333） 2）按校正像差分类： 消色差物镜（achromatic objective） 平场消色差物镜（plan objective） 平场半复消色差物镜（plan fluotar objective） 平场复消色差物镜（plan apochromatic objective） 3）按工作距离分类 长工作距离物镜 普通工作距离物镜 4）按功能分类 相差物镜 偏振光物镜 微分干涉差物镜 5）按镜筒长度分类 有限远物镜 无限远物镜 （二）目镜 组成和作用：由凹凸透镜组成，将物镜形成的倒立 实像放大为10-16倍的虚像。 按目镜视场数可分为：非广角目镜、广角目镜、 超广角目镜等。 对于10 X目镜而言, 视场数18mm，常称为非广角目镜。 视场数≥18mm,常称为广角目镜。 视场数20mm, 常称为超广角目镜。 （三）照明系统 1．视场光阑 2．聚光器 3．光源 1. 视场光阑 视场光阑常位于支架底座上，其光阑大小能连续改变，它通过聚光镜能清晰地成像在标本面上。所以在目镜中