急性颅脑创伤患者脑脊液差异蛋白质组学研究-临床医学;外科学神外专业论文.docx

天津医科大学|{拿士学位论文中文摘要 天津医科大学|{拿士学位论文 中文摘要 目的： 重型颅脑创伤(traumatic brain injury，TBI)患者死亡率很高，在300／o,-．50％ 左右，存活者中也有相当高的致残率，因此，颅脑创伤严重威胁着人类健康， 对社会和家庭造成沉重的经济负担，引起了世界各国的广泛重视。目h；s女n何降 低该病的死亡率和l致残率仍是神经外科领域的难点和热点，对其致病和修复机 制的研究，一直是神经外科领域的热点课题。 在前期研究中，我们通过承担国家自然科学基金资助项目《急性脑创伤后 神经元蛋白质组表达改变的研究》(项目编号，采用蛋白质组学技术 平台，观察了创伤后大脑皮层神经组织内蛋白质组的变化。本研究目的是通过 比较脑创伤后脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)蛋白组的改变，从中寻找脑源 性差异蛋白，并与脑组织蛋白质组改变进行比较，为研究颅脑创伤的分子机制 和生物学标志物的寻找提供宝贵的理论基础。 方法： 在第一部分，我们选用从10例人脑创伤后行颅内压监护的患者中获取的脑 脊液，通过预冷丙酮除盐浓缩，采用蛋白质均衡技术(ProteoMinerTM试剂盒) 去除高丰度蛋白并富集低丰度蛋白之后，进行双向凝胶电泳、硝酸银染色和凝 胶图像处理，建立了高重复性的人类脑脊液蛋白质组中的高丰度蛋白去除方法， 进行了方法学上的验证。 在第二部分，我们选取30例颅脑创伤患者和8例破裂动脉瘤致蛛网膜下腔 出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)但不伴实质内血肿的患者，发病后24小 时内行脑室外引流术，收集的脑脊液样本离心取上清．80℃低温保存，混合样本 预冷丙酮除盐浓缩，采用ProteoMinerTM试剂盒去除高丰度蛋白并富集低丰度蛋 白后，Bradford法测定最终蛋白浓度，由三种荧光(Cy2，Cy3，Cy5)交叉标记的 两种50肛g样品和内标混合，进行双向差异凝胶电泳(two．dimensional differential in—gcl electrophoresis，2D—DIGE)，使用DeCyder v．5．02图像分析软件分析电泳 结果。差异点通过胰蛋白酶胶内酶切、基质辅助激光解吸／电离．飞行时间串联质 天津医科大学博十学位论文谱技术，对肽段的分子量进行测定，通过数据库检索，进行蛋白鉴定，推测其 天津医科大学博十学位论文 谱技术，对肽段的分子量进行测定，通过数据库检索，进行蛋白鉴定，推测其 生物学作用。 结果： 在第一部分中，人TBI后CSF经ProteoMinerTM处理后，经过PDQuest 7．0 软件自动检测到的蛋白质点数为1432±85，与常用的丙酮沉淀法检测到的蛋白 质点数1123±114相比，具有统计学意义(尸0．05，F=8．885)。通过比较CSF 经ProteoMinerTM处理前后2-DE图谱发现，高丰度蛋白减少，低丰度蛋白的分辨 率提高。说明ProteoMinerTM起到了富集低丰度蛋白的作用，可进行下一步研究。 在第二部分的研究中，两组患者的CSF经过ProteoMinerTM富集低丰度蛋白 后进行2D．DIGE分离，得到清晰的脑脊液蛋白图谱。生物学差异分析结果表明， 在外伤组与对照组脑脊液蛋白共存在有表达量变化超过1．5倍的差异蛋白质点 169个，其中在外伤组中表达上调1．5倍以上的有98个蛋白质点，下调1．5倍以 上的有71个蛋白质点。通过质谱鉴定，47个蛋白质点被鉴别出，属于36种蛋 白产物。依据蛋白可能存在的生理功能将其分类为：细胞骨架、参与代谢、信 号传导、应激反应、蛋白合成与代谢和未知功能蛋白。其中铜蓝蛋白、小自蛋 白、KLF6因子、磷脂转运蛋白、SLC25A23、，溴区包含蛋白l、F-bo)c蛋白7与 中．枢神经系统常见疾病有密切关系，在脑创伤急性期内人CSF中首次发现其表 达水平出现变化。 结论： 人脑创伤后的急性期内，创伤造成的机械破坏使脑脊液蛋白质组发生明显 变化，为研究颅脑创伤及其他神经系统疾病提供了最佳窗口。蛋白质均衡技术 可以提高双向电泳的分辨率，有利于低丰度蛋白质的检出。伤后蛋白表达水平 的升高或降低同时存在，在本次研究中发现的具有显著性差异变化的蛋白中， 尽管还需要进一步的验证，但有可能成为评价损伤程度、预测预后的生物学标 志物。 关键词：急性颅脑创伤脑脊液蛋白质组学质谱肽库低丰度蛋白质 lI 天津医科火学博十学位论文Abstract 天津医科火学博十学位论文 Abstract objectives： A hi曲mortality rate about 30％-50％is associated with severe traumatic brain injury(TBI)，few s