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超高效液相色谱法 UPLC：色谱实验室的新高度 超越HPLC 在过去30年间，高效液相色谱法（HPLC）已经成为世界各地实验室应用最广泛的技术之一。这是因为HPLC是一种强大的多用途技术。它的强大体现在其应用范围广泛，覆盖从毛细管级到制备级的各个范围；在相关的检测技术范围内，它是一种多用途技术，能检测多种化合物。从根本上说，目前，HPLC技术的发展方向主要有三个方面：化学、检测器和系统／数据管理。色谱法在这些方面的进展使该技术得到了广泛认可。尽管如此，色谱技术仍有进一步发展的空间。那么，HPLC的未来将是怎样一幅图景？后续有哪些发展成果能扩大和延展这种公认技术的功用？ UPLCTM的定义 液相色谱法的前沿技术正在研发中。北加利福尼亚大学的J. Jorgensen博士和杨百翰大学的M. Lee博士最近都发表了关于色谱实验室未来分析范围的深刻见解。他们的研究为分离科学描绘了一幅新图景。通过使用比以前小得多颗粒，使分离过程达到了一个新的终点。该方法的基本原理体现在范第姆特方程中。范第姆特方程是一个描述线速度与塔板高度（柱效）关系的经验式。 鉴于颗粒大小是变量之一，因此，它可用来描述各种颗粒大小的理论性能（图1）。从图1可以看出，一旦填料的颗粒大小低于2 μm，色谱技术就能达到一个新水平：不仅柱效更高，而且随着流速的提高不会使柱效降低。 图1：这些范第姆特曲线表明过去30年间颗粒大小的减小过程。理论塔板高度的降低意味着效率的提高。但即使是2.5 μm的颗粒，其效率也会在较高的流速下开始下降，而系统反压则会相应增高。如果使用UPLCTM技术和2 μm以下的颗粒，那么即使在较高的线速度下，效率也能得以保持。更短色谱柱和／或更高流速的使用加快了分析速度，提高了分辨率和灵敏度，从而使现在有可能充分利用色谱原理进行分离。 沃特世  这就呈现了这样一种情景：峰容量和分离速度均被提高至新的极限。简言之，峰容量被定义为色谱法每单位时间内所能分辨的峰数量。峰容量和分离速度等性能指标得到提高后的色谱法被称为超高效液相色谱法，或UPLCTM。图2说明了当颗粒大小从5 μm减小至1.7 μm时，增加的峰容量对色谱分离性能的影响。 图2：比较5 μm颗粒与1.7 μm颗粒。峰容量和分辨率显著增加。 速度、灵敏度和分辨率 源于更小颗粒的额外效率可带来更多的明显益处。更短的色谱柱或更高的流速加快了速度，同时小颗粒也提高了分辨率。对于任何给定的分离，都可通过调节这些变量而达到速度和分辨率的最佳组合。图3显示了UPLC与HPLC的速度比较结果。该实验比较了相同分辨率下，3 μm颗粒和1.7 μm颗粒的分离速度；结果表明较小颗粒的分离速度更快。效率的提高还带来了进一步的益处：灵敏度提高。由于分离过程中的区带变窄，因此分析物会更集中在检测点上。当考虑UPLC的仪器设计要求时，将对这一点进行更详细的论述。 应该指出的是：3 μm是15 cm长普通色谱柱颗粒大小的极限。这是在色谱柱达到最佳流速而又不超出市售仪器（使用任何配比的甲醇－水混合溶剂）的压力限制范围的条件下，运行系统所能使用的最小颗粒大小。（注意：迄今为止，用于HPLC的最小颗粒是0.67 μm [3]。）  如上文所述，范第姆特方程式（及其曲线）表明有必要使用2 μm以下的颗粒，以实现柱效的提高。因此，需要能使UPLC构想得以应用于色谱实验室的技术革新2。 图3：顶部的色谱图是分别使用普通（3 μm）HPLC和1.7 μm UPLC得出的5组分混合样品叠加图谱。底部的色谱图是分离过程的前6分钟的展开图，表明UPLC提高了分离速度而又使分辨率保持不变。UPLC的溶剂用量也大幅度减少。 更小的颗粒，更大的峰容量 研制并填充2 μm以下的颗粒至可重现而耐用的色谱柱中本身就是一个挑战。图4显示出了目前实验室常用的5 μm颗粒与建议用于UPLC柱的更小的1.7 μm颗粒的明显差异。目前，非多孔型1.5 μm颗粒已经上市。虽然这类颗粒效率较高，但它们的缺点是表面积较小。表面积小会导致载样量小和保留时间短。为了与HPLC保持相近的保留时间和载样量，UPLC必须使用多孔型颗粒。UPLC需要一种新颖的耐高压多孔型颗粒。填充床的均匀性也是至关重要的；特别是当较短的色谱柱用以保持分辨率的稳定，而同时又要达到加快分离速度的目标时。另一项要求是色谱柱的内表面必须足够光滑，以便于填充较小颗粒。应重新设计色谱柱两端的筛板，使之既能留住小颗粒又能避免堵塞。  图4：为了说明5 μm颗粒和1.7 μm颗粒的显著差异，该扫描电子显微图将两种颗粒与60 μm的人体头发相比较。在测量距离相同时，该头发的直径约等于12个5 μm的颗粒，33个1.7 μm的颗粒。 UPLC系统的设计要求 为了达到颗粒小、峰容量大的分离效果，需要比目前使用的HP