第八章病毒感染的分子生物学检验..ppt

包膜 包膜是包裹在基质蛋白之外的一层磷脂双分子层膜，这层膜来源于宿主的细胞膜，成熟的流感病毒从宿主细胞出芽，将宿主的细胞膜包裹在自己身上之后脱离细胞，去感染下一个目标。 包膜中除了磷脂分子之外，还有两种非常重要的糖蛋白：血凝素和神经氨酸酶。这两类蛋白突出病毒体外，长度约为10至40纳米，被称作刺突。一般一个流感病毒表面会分布有500个血凝素刺突和100个神经氨酸酶刺突。在甲型流感病毒中血凝素和神经氨酸酶的抗原性会发生变化，这是区分病毒毒株亚型的依据。 一、流行性感冒病毒的基因组结构特征 （一）流行性感冒病毒基因组结构 流感病毒的遗传物质是单股负链RNA，RNA与核蛋白（NP）结合，缠绕成核糖核蛋白体（RNP），以密度极高的形式存在。 甲型与乙型流感病毒的RNA由8个节段（单独的单链RNA片段)组成，而丙型流感病毒的基因缺少第六个节段，则由7个RNA片段所组成。每个RNA片段编码一至两个多肽。 所有RNA节段5’端的13个核苷酸及3’端的12核苷酸高度保守，各型病毒间该保守区的序列略有差异。 由于每一个RNA节段的3’端和5’端存在部分互补序列，因此每个RNA节段的3’端和5’端相互结合使病毒RNA环化形成锅柄样结构。 （二）流行性感冒病毒基因组编码产物 流感病毒的基因(vRNA)为-RNA，-RNA即是转录合成mRNA的模板，又是合成+RNA的模板。病毒RNA的转录和复制均在宿主细胞 核内进行。 甲型和乙型流感病毒基因组RNA 第1、2、3节段编码RNA多聚酶； 第4节段编码血凝素； 第5节段编码核蛋白； 第6节段编码神经氨酸酶； 第7节段编码基质蛋白； 第8节段编码一种能拼接RNA功能的非结构蛋白。 型流感病毒基因组RNA第4节段可同时编码血凝素和神经氨酸酶。 二、流行性感冒病毒的分子生物学检验 （一）流行性感冒病毒核酸检验 1、RT-PCR RT-PCR技术从基因水平检测病毒，具有高度的敏感性和特异性，克服了病毒分离周期长的缺点。 2、实时定量RT-PCR 可以对病毒模板RNA定量，具有操作简便快捷、特异性强、灵敏度高等特点。2009年甲型H1N1流感暴发以后，WHO推荐使用探针荧光定时RT-PCR检测方法。 3、基因芯片技术 用以监别流感病毒型和亚型。 4、RT-LAMP (逆转录-环介导等温扩增) 可以对RNA分子进行有效扩增。该技术特异性强；敏感性高，比传统PCR高出其不意10~1000倍；简便快速，30~60分钟即可判断结果；结果易于判读，肉眼观察浊度或颜色。 （一）流行性感冒病毒的分型 流感病毒变异有抗原性变异、温度敏感性变异、宿主范围以及对非特异性抑制物敏感性等方面的变异，但最主要的是抗原性变异。特点是表面抗原HA和NA易变异。 变异有两种形式，即抗原性转变和抗原性漂移。 抗原性转变 变异幅度大，属于质变，即病毒株表面抗原结构一种或两种发生变异，与前次流行株抗原相异，形成新亚型（如H1N1→H2N2、H2N2→H3N2），由于人群缺少对变异病毒株的免疫力，从而引起流感大流行。 抗原性漂移 变异幅度小或连续变异，属于量变，即亚型内变异。一般认为这种变异是由病毒基因点突变和人群免疫力选择所造成的，所引起的流行是小规模的。 两种不同的流感病毒同时感染宿主细胞，新生的子代病毒可获得来自两个亲代病毒的基因片段，成为基因重配病毒，形成新亚型 。 如：1978年前苏联流行的甲型流感病毒H1N1与香港甲型流感病毒H3N2同时感染人则分离出H3N1亚型 。 基因重配只发生于同型病毒之间，是产生甲型流感病毒抗原突变株、引进流感世界大流行的一个重要原因。 同时，流感病毒基因组RNA在复制过程因其RNA多聚酶缺乏较正功能，常常发生点突变，导致产生抗原性变异株的概率大大升高。 人流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型。 根据甲型流感病毒表面抗原血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）结构及基因特性的不同可以分成若干亚型，至今已发现甲型流感的HA有16个亚型（H1~H16），NA有9 个亚型（N1~N9），它们之间的随意组合可形成多种亚型，各亚型之间无交叉免疫力。 亚型的检测对于流感病毒的鉴定、流行病学的研究、抗原变异的研究等都具有十分重要作用。 亚型鉴定常用：核酸杂交、RT-PCR、多重RT-PCR、酶免PCR、荧光RT-PCR、NASBA和芯片技术。其中RT-PCR是其他各种方法的基础，在流感病毒的型别鉴别时，扩增的目的片段常常是高度保守的核蛋白和M蛋白；如果用于甲型流感病毒的亚型鉴定，设计的引物常常针对编码表面抗原基因5’端和3’端的保守序列。 （三）流行性感冒病毒的耐药性分析 特异性抗流感病毒药物主要是M2蛋白抑制剂和神经氨酸酶抑制剂。M2基因或NA基因的突变是流感病毒耐药的主要原因。 基因