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生物工程上游技术实验综合实验设计 利用不同的方法筛选和鉴定转化子 牛命科学学院 生工121 指导老师：皿长恩、周玉萍 摘要 本次实验我们小组通过含Amp的培养基初步筛选出转化子、菌落直接PCR、摇菌培养观察 细菌表达形态等一系列实验方法，从6个转化子中筛选出了 2个目的重组子.，从而达到实 验的基木目的，基木掌握了转基因工物筛选鉴定的基本方法。 关键词 筛选、菌落直接PCR、摇菌培养、电泳 引言 在质粒载体上进行克隆时，山于重组质粒转化的大肠杆菌的量少，连接产物没有也不可能 在经过分离纯化而获得纯的重组质粒，连接产物中混有载体口连而成的空载体、载体与冃的 片段连接而成的冃的重组质粒和载体与非冃的片段连接而成的非冃的重组质粒。同时，宿主 的转化效率极低，因此，绝人部分宿主是没有被转化的，所以很有必要对转化产物进行筛选 与鉴定。首先，通过抗牛索抗性从转化后代小筛选出转化子。然后，通过菌落直接PCR从 转化子中筛选出候选转基因生物。最后，摇菌培养观察菌株表达形态。 通过抗生素抗性筛选，从转化后代中筛选出转化子。因为非转化菌没有质粒血缺乏相应的 抗生素抗性，所以口J将转化产物涂布在含冇相应抗生素的培养基上筛选，只冇含冇相应抗性 的抗牛?素抗性基因才能牛?长繁殖形成菌落。 通过菌落直接PCR从转化子小筛选出转基因生物，扩增出特殊目的基因片段，判断所得 转化子是否为重组子。但因为PCR技术的高灵敏性，往往会产生假阳性结果，所以有必要 进一步进行鉴定从候选重组子中进行摇菌培养关注菌株表达形态，若出现荧光蛋白则说 明菌株成功转化并表达了 GFP荧光蛋白。 三、使用仪器、材料 1、 材料：实验九准备好的菌株。 2、 实验仪器及设备:PCR仪、恒温摇床、台式高速离心机、恒温水浴锅、琼脂糖凝胶电泳装 置、电热恒温培养箱、电泳仪、超净工作台、微量移液抢、1.5mL离心管等。 3、 主要试剂：10XPCR buffer、dNTP mixture 前向引物(Pl)、反向引物 r(P2)、iTaq 酶、 火菌蒸馆水、LB液体培养基： 四、实验步骤 1、 转化子筛选：在实验九含冇Amp的筛选培养基中长出的菌落中挑选出6个白色单菌 落，并做好标记，这6个单菌落即为转化子。 2、 菌落直接PCR：用无菌牙签把6个白色单菌落，先在编好号的6支PCR反应管中的 底部分别涂擦，然后在PCR管屮配制60卩L反应体系.并按每管9卩L分装好反应体 系。反应体系如下： DNA template buffer (用牙签挑取菌落在PCR管中涂抹) 10XPCR buffer 6u L dNTP mixture 4.8 U L 前向引物(Pl) 2.4 uL 反向引物r(P2) 2.4uL rTaq 酶 0.2 u L 灭菌蒸馅水 43.8 u L 所有试剂按最仔细添加后，轻轻混匀,稍离心即可撚后每支PCR涂抹反应管内分装9 u L 为了防止反应混合液蒸发履后添加15 口 L矿物油 PCR仪的参数设置 94 °C 4min 94 °C 30s 61 °C 30s 72 °C 50 72 °C 5 min 40 cycles 琼脂糖凝胶电泳检测： PCR反应结束后，往每只PCR反应管加入2uL的6X loading buffer,稍离心 混匀后从每支PCR管中取6uL产品点样，电泳15min.观察产物带。 3、配置LB液体培养基，称胰蛋白月东10g,酵母提取物5g,NaCl 10g于1000ml 的三角瓶中，加入1000ml蒸憾水搅拌溶解，然后用“40旷调卩”至7?5,加 塞，包扎瓶口。并把电泳结果中有荧光条带的4个样品分别接种到装有15讷 培养液的锥形瓶屮，然后将锥形瓶放置到摇床屮过夜恒温培养，于第二天 观察菌株生长情况。 五、实验结果及分析 1 23456 (这是我们小组的6个样本) 图一菌落直接PCR电泳图结果分析：有电泳图中可以看岀六个电泳样本中笫1、2、3、4、6号泳带都扩增 出特异性条带，表明这五个菌落的菌PCR结果为阳性，说明第1、2、3、4、6 号菌是所需鉴定的重组子。我们选取了 1、3、4、6号这4个样本做了下面的摇 菌培养处理，实验效果图如下： 1号3 1号 3号 阴性对照阳性对照 4号 6号 阴性对照 阳性对照 图二摇瓶培养的菌落生长情况 结果分析：从摇菌结果可以看出3号，6号菌株出现了荧光效果（图片出于像索 原因只能看出浅浅的绿光），因此可以得出结论3号、6号菌是成功转化并表达 GFP荧光蛋白的菌株，实验结果符合实验预期。 六、参考文献 《生物工程上游技术实验书册》出氏恩科学出版社 《基因工程技术》冯斌谢先芝编著化学化工出版社 《生物技术综合实验》刘晓晴编 科学出版社