第六章 酶抑制法和免疫测定技术.ppt

第六章 酶抑制法和免疫测定技术 目的要求：生物测定技术以其简单、快速、特异性强、样品量少而得到迅速发展，应用酶抑制技术、酶联免疫技术、生物技术等快速测定农药残留，已成为一定的市场需求，但此类方法仍只能达到定性和半定量的水平。 通过本章的学习，目的是使学生掌握酶制技术、酶联免疫技术等常用的快速测定农药残留的方法，了解与免疫法相关的一些知识。 学习要点　 1、一般了解：农药残留生物检测技术的问题和展望。 2、一般掌握：生物传感器在农药残留检测中的应用。 3、重点掌握：酶抑制技术；酶联免疫技术；生物技术等快速测定农药残留方法等。 复习思考题 * * 学习指南 观察思考 课外阅读 复习自测 退出本章 演示文稿 本章目录 辽农职院 工程系 质检中心 * 第六章 酶抑制法和免疫测定技术 本节首页 退出本章 一、酶抑制分析测定法 1、酶法概述 2、酶法检验原理 3、酶原 4、底物与显色剂 5、测定方法 二、免疫检测技术 1、免疫反应 2、免疫分析 3、酶联免疫吸附测定法 4、农药抗体制备 5、ELISA法的特点 本节首页 退出本章 一、酶抑制分析测定法 1、酶法概述 本节首页 退出本章 真性胆碱酯酶与胆碱能神经的生理功能极为密切。其生理功能是，当神经冲动到达胆碱能神经末梢时，突触小泡内的Ach外排至突触间隙，作用于突触后膜的胆碱能受体，引起下一级神经元或效应器的激发。在正常生理条件下，Ach完成传递冲动作用后，随即被突触后膜上的AchE在数毫秒内水解，生成乙酸和胆碱。 2、酶法检验原理 本节首页 退出本章 神经性毒剂分子中含有亲电子的正磷原子(Pδ+)，它与Ach分子中的正碳原子(Cδ+)同样具有亲电子性质。但神经性毒剂的亲电子能力此Ach强，这是因为毒剂分子中，P＝O和P-F键上的O、F原子相对电负性比P原子大得多(相对电负性P＝2.1，O＝3.5，F＝4.0，CS＝2.5)。因此，相对电负性大的O、F原子吸收电子成为负极，使P成为低电子密度的正极，即P原子带有较多的正电荷和更强的亲电子能力。所以神经性毒剂对AchE有更大的亲和力和抑制力。 (1)神经性毒剂对AchE的抑制机理 本节首页 退出本章 胆碱酯酶根据其水解基质的专一性和速度不同分真性胆碱酯酶和假性胆碱酯酶，前者又称乙酰胆碱酯酶(AchE)，后者包括丁酰胆碱酯酶(BuchE)和丙酰胆碱酯酶(PrchE)。 假阳性：水果、蔬菜的提取物中含有对有抑制作用的杂质，如氯代烟碱类物质。 (2)对胆碱酯酶的抑制作用 ① 假阳性 本节首页 退出本章 敌敌畏 乙酰胆碱 AchE ② 产生假阳性的作用机理 3、酶 原 本节首页 退出本章 蜜蜂头的脑酯酶液 条件：3日龄，-20℃ 0.24g/ml磷酸缓冲液（pH7.5） 保质期：3个月 4、底物与显色剂 本节首页 退出本章 乙酰胆碱+H2O→胆碱+乙酸 pH为6.2（黄） →7.6（蓝色） （1）乙酰胆碱-溴百里酚蓝 本节首页 退出本章 乙酸-β-萘酯固蓝B盐+H2O→ β-萘酚+乙酸（紫红色） （2）乙酸-β-萘酯固蓝B盐 本节首页 退出本章 （3）乙酸羟基吲哚显色法 乙酸羟基吲哚+H2O→吲哚酚+乙酸 吲哚酚+O2 →靛蓝（蓝色） 本节首页 退出本章 （4）乙酸靛酯显色法 乙酸靛酯+H2O→靛酚蓝（蓝色）+乙酸 水解 加酶 显色剂 未水解 显色剂 不显色 显色 5、测定方法 （1）测定原理 无农药 有农药 5、测定方法 加入20ml提取试剂 提 取 取2g样品（非叶菜类取4g），切碎 取 样 振荡1~2min 抑制反应 将上清液倒入试管中，静止3min，加入50ul酶，3ml样品提取液，50ul显色剂 培 养 倒入比色杯测定 仪器测定 （2）、比色法 本节首页 退出本章 （3）、酶片法 酶片为浸渍有胆碱酯酶的或其他敏感酯类的滤纸片或类似载体物质，其基本技术原理与比色法相同。 本节首页 退出本章 6、技术问题 （1）分析对象：有机磷、氨基甲酸酯类 （2）灵敏度不高，需用GC进一步定性和定 量、重现性不好 （3）农药含量影响酶抑制程度 （4）影响因子：酶的浓度、温度、pH 本节首页 退出本章 二、免疫检测技术 Pathogen 1、免疫反应 本节首页 退出本章 免疫反应：细菌、病毒→入侵→抵御的抗体，即识别和排除进入体内的抗原性异物的保护性反应。 抗原：外来物 2、免疫分析 本节首页 退出本章 免疫分析：以抗原和抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析方法。 免疫反应特点：高度选择性。 本节首页 退出本章 3、酶联免疫吸附测定法 ELISA（Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) 原理：在测定过程中，样品提取液中的农药与已知数量的酶联剂竞争有限数量的抗体吸附位