第六章酶学分析技术.ppt

酶活性单位 惯用单位 惯用单位是酶活性测定方法的建立者所规定的单位。由于单位定义不同，参考范围差别很大，难以进行比较。 国际单位（IU） 在特定的条件下，每分钟转化1?mol底物的酶量为一个国际单位。 以IU表示，1IU=1?mol.min-1。 Katal单位 在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的酶量为1kat， 1kat=1mol.s-1。常用单位为?katal或 nkatal。 Kat与IU的换算关系为： 1IU=1?mol·min-1=16.67nmol·s-1= 16.67nkatal 二、酶的结构与催化作用 单纯酶和结合酶 单纯酶：只含多肽链，是单纯蛋白质。 结合酶：由酶蛋白和辅因子组成。 两者结合后形成的复合物称为全酶。 与酶蛋白结合疏松的称为辅酶。 与酶蛋白结合牢固的称为辅基。 酶的活性中心 　　酶与底物结合并将底物转变成产物发生在酶表面的一个特定区域。 酶的催化作用机制 　　 诱导契合学说。 二、Km与Vmax Km值：等于酶促反应的初速率为最大速率Vmax一半 时的底物浓度，即V＝?Vmax时，则Km＝[S]。Km 在临床上的应用： 　 反映酶与底物的亲合力，且与亲合力成反比。 用来计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最 　 　 大反应速度的百分率。 　 根据Km值选择酶的最适底物。 确定工具酶用量。 确定代谢酶系中的限速反应和作为鉴别酶的依 据。 Vmax：酶完全被底物饱和时的反应速度，代表了在一 定酶量下的最大反应速率。 三、酶促反应进程曲线 四、影响酶促反应的因素 1.底物浓度 2.酶浓度 3.温度 4.pH 5.抑制剂 6.激活剂 7.辅因子 针对酶学检验 酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度（v）达到最大速度Vmax，即在过量底物存在下的零级反应期的速度，此时反应速度与酶浓度[E]之间存在线性关系。 1.按反应时间分类: 定时法 连续监测法 2.按检测方法分类： 量气法、分光光度法、荧光法 其它方法（ 放射性核素法、离子选择电极法，旋光法、极谱法、HPLC或生物发光法等）。 定时法（固定时间法） 测定酶与底物作用反应一定时间后底物或产物变化的总量，计算酶促反应平均速度。 优点：比较简单，最后测定时因酶促反应已被终止，故所用仪器无需恒温装置，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。 缺点：无法知道在整个酶促反应进程中是否都处于线性期。 利用该法测定酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要非常精确，否则会引起较大误差。 连续监测法 又称速率法或动力学法，指在酶促反应过程中用仪器监测某一反应产物或底物的浓度随时间 的变化量，求出酶反应初速度，间接计算酶活 性浓度的方法。 优点： 无须终止酶促反应，不需添加其它成色试剂， 就反应物变化的多点测定结果连接成线，观察 到整个反应过程，选择线性反应期来计算酶活 性，结果准确可靠。 要求检测仪器具有恒温装置及自动检测功能，自动生化分析仪都能达到这些要求。 连续监测法的种类 酶活性浓度单位 临床上酶活性浓度采用每单位体积（升）所含的酶活性单位数表示。 酶活性浓度单位的计算 连续监测法根据摩尔消光系数进行酶活性浓度的计算。 公式如下： 用自动生化分析仪测定同一酶，条件固定时，从理论上来讲V、v和L均为固定值，?为常数，则将公式 简化为 如LD活性浓度，已知NADH的?为6.22?103·cm-1.mol-1，血清量为50?l，底物液为1ml，比色杯光径为1cm，则 K=1.05?106/6.22? 103?0.05?1=3376 连续监测法中常数K值的设置 测定酶的判断值或参考范围上限，保证测定的可靠，所 以转氨酶的常数K一般在3000左右，不少人宁愿在1500 左右。 应考虑到测定时间，测定时间短到0.5分，此时0.001嗓 音对每分钟△A误差将是0.002，反之，测定时间延长 到2分钟，误差也小一半。即测定时间长，则K值可以 设置大一些，如测定时间只有0.