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现代生药学概论 分子生药学部分 Molecular Pharmacognosy AFLP在分子生药学中的应用 AFLP技术可产生丰富而稳定的遗传标记，它可以用于药用植物遗传分析的各个方面，如分类、系统发育、品种鉴别、遗传图谱构建及目的基因的定位等。 植物基因表达和调控的研究技术——分子杂交 分子杂交技术从开始应用到现在已有30余年历史，最初出现的核酸分子杂交主要是在DNA与RNA之间进行。RNA是DNA的一条链转录而成的，因此RNA与DNA模板链之间存在对应的碱基互补关系。在碱性环境、加热或加入变性剂等条件下，双链DNA之间的氢键被破坏，两条链解开成为两条单链。这时如果加入其转录产物RNA并在一定离子强度和温度下保温，则RNA与模板链可形成稳定的RNA-DNA异质双链。形成异质双链的过程称为杂交。由于杂交是在分子水平进行的，所以称为分子杂交，形成的异质双链分子称为杂交分子。随后这一技术又发展到具有相似核苷酸序列的不同DNA分子之间的杂交，以及RNA分子、蛋白质分子之间的杂交。 分子杂交主要包括两大部分内容，一是核酸分子杂交，其中又包括Southern杂交和Northern杂交；二是属于蛋白质分子杂交的Western杂交。二者分别在基因整合、转录和表达的不同阶段对目的基因进行检测和定位。 分子杂交实验主要涉及三大部分的内容：（1）杂交探针的制备；（2）被检的核酸或蛋白质样品制备；（3）印迹及杂交。 Southern杂交 Southern转移是用一块硝酸纤维素膜或尼龙膜贴在琼脂糖凝胶上，通过一定的机械压力以及毛细作用，在琼脂糖凝胶中的缓冲液渗出的同时也把DNA分子带出凝胶结合有膜上，使转移后的膜上“复制”有所有的琼脂糖凝胶中的DNA条带。用膜来作杂交不但方便得多，而且结果清晰，背景低。具体过程是将被检的DNA样品提取出来，用限制性内切酶酶切，生成的酶切片段中，必有目的基因片段或含目的基因序列的片段，用琼脂糖凝胶电泳分离，各片段按分子大小依次分开，排布在凝胶上。利用印迹技术将变性的各酶切片段由凝胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，经烘干或紫外线照射处理，使印迹的各片段与膜牢固结合，这样使各片段在膜上的相互位置与在凝胶上相同。 印迹完成后，经预杂处理，掩盖膜上的非特异性杂交位点后，将膜放入含有单链或经变性处理成单链的探针杂交液中，在适宜的条件下进行杂交。膜上与探针同源的单链序列，可通过碱基互补作用与探针杂交成双链，从而使探针固定在相应的位置上。目的基因与探针同源，凡含有目的基因的序列的片段都可以发生杂交，形成带标记的特异性杂交体。在杂交过程中或许也会发生一些非特异性的杂交及探针与膜上非特异性位点结合，这些非特异性的结合及未结合的游离的探针可以通过杂交后的漂洗过程而逐步除去。 （a） （b） （c） （d） （e） 基因组DNA DNA限制片段 硝酸纤维素滤膜 同探针同源杂交的基因DNA片段 X光底片 Northern 杂交 经变性凝胶电泳分离的各RNA由凝胶转移到固相膜上称为Northern杂交。印迹原理及方法同于Southern杂交。 Western 杂交 Western杂交是检测蛋白质的一种方法。当目的基因正常表达时，细胞内会产生一定量的相应的特异蛋白，即目的蛋白。将此目的蛋白提取出来，溶解于含去污剂和还原剂的溶液中，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质按分子大小分离，将分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜上，膜在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭非特异性位点。然后加入特异抗体（一抗），印迹上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一结合的标记的二抗，最后通过二抗上标记化合物的性质进行检出。 植物遗传转化技术 植物遗传转化（genetic transformation）是指利用重组DNA技术，细胞组织培养技术或种质系统转化等技术，将外源基因导入植物细胞或组织，获得转基因植物的技术。目前，转化技术大体可分为三类： 1 农杆菌介导的基因转移。 2 以原生质体或细胞作为受体的直接基因转移。如电击、基因枪法、超声波法等。 3 种质系统的基因转移。如子房注射、种胚及花粉等途径导入外源基因。 * * 第一篇 概论 第二篇 分子生药学研究方法及其基本技术 第三篇 分子生药学的研究领域 内容 1 生药及生药学的定义2 生药学的发展历程3 分子生药学产生的背景4 分子生药学定义及其研究对象 5 分子生药学研究内容 6 分子生药学研究的方法 7 分子生药学与相关学科的关系 第一篇 概论 一、生药及生药学的定义 生药:　来源于天然的、未经加工或只经简单加工的植物、动物和矿物药材。相当于中药材。另外直接用于医疗保健或作为医药用原料、辅料的天然药物，也列入生药的范畴。如植物中制取的淀粉、粘液质、挥发油；自植物和动物中制取