第4章 基因组、转录组和蛋白组.ppt

基因组、转录组和蛋白质组Genomes, Transcriptomes and Proteomes结构基因组学、功能基因组学、比较基因组学 概念 基因组 是指一个单倍体细胞中遗传物质得总量。染色体或基因 蛋白质组研究的意义 基因虽是遗传信息的源头，而功能性蛋白是基因功能的执行体 肿瘤组织与正常组织之间蛋白质谱差异，找到肿瘤特异性的蛋白分子，可能会对揭示肿瘤发生的机制有帮助，目前已应用于肝癌、膀胱癌、前列腺癌等研究中。 开发新蛋白质、获得新基因 基因组的表达不仅仅是一个遗传信息由DNA-RNA-蛋白质的一个过程，这个法则忽略了信息流由基因组到蛋白质组传递过程是被调控的，这个过程每一步都是受到调控，从而使得转录组和蛋白组的成分能够做出迅速和准确的改变，并能使细胞调整自己的生化状态能对外界的刺激做出反应， 转 录 组 Transcriptomes 转录组是特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，包括ｍＲＮＡ和非编码ＲＮＡ。 蛋白质是行使细胞功能的主要承担者，蛋白质组是细胞功能和状态的最直接描述，而由于目前蛋白质实验技术的限制，转录组成为研究基因表达的主要手段。转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的必然纽带，转录水平的调控是目前研究最多的，也是生物体最重要的调控方式。 编码和非编码RNA 细胞的RNA含量可以分为两类 编码RNA 非编码RNA 编码和非编码RNA 编码RNA mRNA 4% 寿命短 细菌的mRNA半衰期几分钟， 真核细胞大部分mRNA的半衰期也只有几小时 转录组的成分不是固定的，可以通过快速的改变mRNA的合成来改变 编码和非编码RNA 非编码RNA rRNA tRNA 真核生物特有的RNA 小核RNA（Small nuclear RNA） (snRNA; 也叫 U-RNA ）参与前体mRNA的剪接 小核仁RNA(Small nucleolar RNA) (snoRNA),参与rRNA前体的加工以及 核糖体亚基的装配。 小胞质RNA(scRNA), 包括几种，有些功能已知，有些功能还未知 小核RNA（ snRNA,核内小RNA） 存在于真核细胞的细胞核内，为小分子核糖核酸，长度为106-189个核苷酸。 作用：参与hnRNA 的剪接和转运。 hnRNA：核内不均一RNA，是成熟mRNA的前体。 转录组研究的应用领域 转录组检测的方法 （一）构建cDNA文库并测序 （二）基因表达序列分析技术 Serial analysis of gene expression (SAGE) （三）利用DNA chip 可以比较不同的转录组 （四）大规模平行信号测序系统MPSS(massively parallel signature sequencing,MPSS)。 （一）cDNA文库(cDNA?library)的构建 cDNA:以RNA为模板，在反转录酶的作用下合成的DNA cDNA基因文库：从一定生长阶段或条件的某种细胞分离到的全部mRNA经反转录成 cDNA后再重组和增殖形成的基因文库。 cDNA文库的优点 cDNA不存在间隔序列 （二）基因表达序列分析技术 Serial analysis of gene expression (SAGE） 表达的基因和表达丰度 Sage技术的主要理论依据 一个短得寡核苷酸序列（12bp）含有鉴定一个转录物特异性的足够信息，可以作为区别转录物的标签（tag）4 这些标签串联在一起，形成大量多联体（concatemer），对每个克隆到的多联体进行测序并应用SAGE软件分析，可确定表达的基因的种类和丰度 用生物素酰化的oligo（dT）引导合成cDNA第一链，再合成双链cDNA，用专门识别4bp碱基的锚定酶（anchoring enzyme），如NlaIII(识别位点为CATG)消化合成的双链cDNA,释放5‘序列，而生物素酰化的3’端仍被吸附在链霉亲和素蛋白磁珠（streptavidin－coatedbeads）上 分离与磁珠结合的具3‘端poly（A）尾巴的cDNA片断，与含有IIS类限制酶位点的接头连接，酶切位点一般位于识别位点后20bp处，再用标签酶（tagging enzyme），如BsmFI等IIS类限制酶处理样品，释放带有接头的SAGE标签 带有接头的SAGE标签经DNA聚合酶（Klenow）补平后，由连接酶产生带有两个接头的双标签（ditag），对双标签PCR扩增后，再用锚定酶消化,得到尾尾相连的SAGE双标签，双标签的两端分布着锚定酶的酶切位点 去除接头的SAGE双标签彼此连接形成长短不一的多联体，电泳分离后收集大小适中的片段克隆到高拷贝的质粒载体，由此形成SAGE库 随机挑选SAGE库中的克隆测序，用专门设计的SAGE软件分析得